低氘水抑制宫颈癌Hela细胞增殖和侵袭能力的研究(3)
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1.6 Western blot法检测Hela细胞p21蛋白的表达水平
按实验“1.3”项下方法收集Hela细胞并计数，以1×105个细胞/mL的密度接种于直径6 cm培养皿中，分别加入含10%FBS的普通1640培养基(150×10-6，对照组)或含不同氘浓度(100×10-6、75×10-6、50×10-6)的1640培养基(实验组)培养24 h，弃培养基，PBS洗涤3次，加入细胞裂解液RIPA 200 μL裂解，并加入蛋白酶混合抑制剂20 μL，置冰上30 min让其充分裂解，细胞刮子收集细胞，4℃、10 000 r/min离心15 min，吸取上清液分装置-80℃备用。NanoDrop微量紫外分光光度计测定蛋白含量，各孔的蛋白上样总量一致，均为100 μg。电泳浓缩胶80 V，50 min，分离胶110 V，150 min。经过10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，110 V 500 mA转膜120 min，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。采用室温含2.5%脱脂奶粉的PBST (400 mL PBS+40 μL 吐温20) 封闭60 min，按抗体要求的比例加入兔抗p21一抗(1∶3000)、兔抗β-actin一抗 (1∶3000)，4℃过夜，室温复性1 h，PBST洗膜4次，10 min/次，按一定比例(1∶10000)加入相应的Alexa Flour 800 goat anti-rabbit lgG(H+L)二抗 ......
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