铜绿假单胞菌肺部感染对小鼠Toll样受体2\4的影响(2)
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1 仪器与试药
1.1 动物与菌株
选用清洁级健康雄性Balb/c小鼠56只，6~8周龄，体重18~20 g，由上海交通大学附属第六人民医院动物房提供。铜绿假单胞菌(ATCC27853)购于中国科学院微生物研究所。
1.2 药物试剂与仪器
盐酸氯胺酮注射液(福田古田药业)，低熔点琼脂糖(Bio Basic，加拿大)，引物设计与合成(上海生物工程)，小鼠IL-6、IL-17 ELISA试剂盒(R&D，美国)，一步法PrimeScript RT-PCR试剂盒(大连宝生物工程)，7500 real time PCR仪(ABI，美国)，Wellscan MK3全自动酶标仪(Labsystem Dragon，芬兰)。
2方法
2.1 包被PA琼脂糖悬液的制备
参照朱松雷等[4]的方法将冻存的标准菌株制作成包被PA的琼脂糖珠后，取微量的PA琼脂糖悬液以10的倍数稀释液接种到羊血琼脂板上，37℃ 5%CO2孵育24 h后观察菌落进行计数，以做参照调整琼脂糖悬液浓度至5×108 CFU/mL。
2.2 动物模型制作
将56只健康小鼠随机分成两组，其中，感染组34只，经气管接种含有PA的琼脂糖悬液，对照组22只小鼠接种无菌的琼脂糖悬液。参照文献[4]的方法将50 μL PA琼脂糖悬液和无菌琼脂糖悬液分别接种感染PA组小鼠和对照组小鼠气管内，伤口予酒精消毒，不做缝合。此操作过程中感染组和对照组分别有4只和2只小鼠术后死亡。每日观察小鼠饮食情况、呼吸状况及体重变化等生理特征。接种后第1、3、5、7、10天各处死对照组小鼠4只，感染组6只。
2.3 标本收集与处理
2.3.1 标本的制备分别于各时间点取小鼠肺泡灌洗液(BALF)1.5 mL，ELISA法检测BALF中IL-6、IL-17的变化。取小鼠右上肺称重研磨培养，计数肺组织菌落；右下肺置于10%中性甲醛溶液中固定，制成石蜡切片，采用苏木精-伊红(H-E)染色。取左肺置-80℃冰箱保存，用于检测肺组织中TLR-2 mRNA和TLR-4 mRNA的含量。根据表1标准对病理切片进行评分[5]。
表1 肺组织的病理评分标准
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