沉默HepG2细胞核糖核酸酶抑制因子的shRNA逆转录病毒载体的构建及鉴定(2)
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参见附件。
1.2.2 HepG2细胞培养和转染细胞用DMEM培养基进行培养，补加0.03%谷氨酰胺，0.2% NaHCO3，0.59% Hepes(pH 7.2)， 10%热灭活(56℃，30 min)的胎牛血清及双抗(青霉素和链霉素各100 U/mL)，培养条件为5%的CO2，培养温度37 ℃。细胞按4×104个/孔铺板于24孔板，至90%~95%汇片时，按CellfectinR说明书转染并分组：①空白组(正常细胞)；②空载体组(pLNCX-pKD载体转染组)；③干扰组(pLNCX-pKD-dsRI载体转染组)，每组2复孔。每组质粒共用0.8 μg、脂质体2 μL，转染后24 h，换成含600 μg/mL G418的培养基培养选择2周，挑取G418的抗性单克隆，繁殖、扩增。
1.2.3 mRNA转录水平的检测采用Trizol试剂分别提取各孔中细胞的总RNA。使用RT-PCR试剂盒按照两步法进行RT-PCR反应。以总RNA逆转录合成的cDNA为模板进行PCR反应。用于检测内源表达的RT-PCR引物：5'-gacatccagtgtgaggagctgagcg-3'，5'-ccagcctcattgatgtcgttgttgc-3'，上游引物位于hri基因的No.27 bp，下游引物位于hri基因的No.559 bp，产物长度约为527 bp。β-actin引物 5'- gctgtccctgtacgcctctg-3'，5'-tgccgatggtgatgacctgg-3'，产物长度约为300 bp。由Bio-Rad凝胶成像仪摄取图像，Image LabTM软件对各个条带测定其面积及灰度值。用目的基因条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值表示目的基因的相对表达强度 ......
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