异烟肼诱导致单耐异烟肼结核分枝杆菌假定药物外排泵基因表达量变化的初步研究(2)
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1 材料与方法
1.1 材料
本次研究的菌株均是由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所结核室所提供，30株单耐异烟肼结核分枝杆菌分离株、20株全敏结核分枝杆菌分离株、H37Rv(标准对照)。
1.2 仪器与试剂
ADC营养添加剂与Middlebrook 7H9干粉(美国BD公司)、异烟肼药物干粉(美国Sigma公司)、Trizol试剂(美国Invitrogen公司)、Alamar blue试剂(美国ABD Serotec公司)；除去DNA试剂盒(美国Invitrogen公司)、荧光定量PCR仪器(美国伯乐公司)、反转录试剂盒与荧光染料法Real-time PCR试剂(康为公司)。
1.3 基因组检测
基因组主要是采取十六烷基三甲溴化铵(CTAB)法进行检测，并且采取直接测序法进行检测异烟肼耐药的相关基因。同时，将PCR产物进行单向测序，并且采取生物信息学软件对其进行基因序列和H37Rv基因序列进行对比分析，基因型的检测采用Spoligotyping法进行辨别[7]。
1.4 最小抑菌浓度(MIC)检测
结核分枝杆菌异烟肼的MIC主要是采取微孔板Alamar blue显色法进行测定[8]。培养基中异烟肼的浓度为0.2 μg/mL，对于异烟肼MIC≤0.25 μg/mL的菌株，需要再次进行低浓度药物的梯度稀释，异烟肼需要按照0.0005～0.5 μg/mL的2倍系列稀释，蓝色完全没有发生改变为最小药物浓度。
1.5 假定药物外排泵基因检测
①依据N37Rv菌株全基因组序列进行管家基因secA1与27个假定药物外排泵基因的选择并设计引物。②细菌总RNA的制备，采取Trizol法进行提取总RNA，采取分光光度计进行测定总RNA的纯度与浓度状，以此进行质量测定。③去除DNA的污染，将提取的总RNA进行去污处理。经过上述的方法提取总RNA ......
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