细胞因子信号转导抑制剂3在大鼠静脉移植物中的表达及意义(3)
表1 引物序列
1.2.4 Wertern blotting检测IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1β、ICAM-1、STAT3、P-STAT3、SOCS3蛋白表达 从液氮罐中取出另一份移植静脉放入EP管中，收集细胞，均立即置于冰上，移液器分别滴加细胞裂解液150 μL和蛋白酶抑制剂4 μL，静置30 min，4℃、10 000 r/min离心5 min，提取上清。上清液中包含提取的总蛋白。BCA法测定蛋白浓度。取样品蛋白40 μg依次进行电泳和湿转，用浓度为5%的脱脂奶粉在室温条件下封闭1 h。分别滴加不同比例稀释过的相应鼠抗多克隆抗体磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)(1∶800)、IL-6(1∶400)、MCP-1(1∶1200)、TNF-α(1∶800)、IL-1β(1∶2500)、ICAM-1(1∶800)、STAT3(1∶800)、P-STAT3(P Ser727，1∶800)及SOCS3(1∶800)，4℃冰箱中过夜孵育，TBST缓冲液冲洗硝酸纤维素膜10 min×3次。滴加稀释度为1∶2000的驴抗羊二抗辣根过氧化物酶(HRP)，室温孵育1 h，TBST缓冲液洗膜10 min×3次。按照ECL发光试剂盒说明书要求在暗室内发光曝光。应用图像分析处理软件Glyo Bandscan 4.3分析相应的目的蛋白和内参电泳条带的灰度值，目的蛋白相对表达水平等于目的蛋白条带灰度值与样本GAPDH灰度值的比值。
1.3 统计学方法
应用SPSS 17.0统计软件处理数据，计量资料数据均以均数±标准差(x±s)表示 ......
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1.2.4 Wertern blotting检测IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1β、ICAM-1、STAT3、P-STAT3、SOCS3蛋白表达 从液氮罐中取出另一份移植静脉放入EP管中，收集细胞，均立即置于冰上，移液器分别滴加细胞裂解液150 μL和蛋白酶抑制剂4 μL，静置30 min，4℃、10 000 r/min离心5 min，提取上清。上清液中包含提取的总蛋白。BCA法测定蛋白浓度。取样品蛋白40 μg依次进行电泳和湿转，用浓度为5%的脱脂奶粉在室温条件下封闭1 h。分别滴加不同比例稀释过的相应鼠抗多克隆抗体磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)(1∶800)、IL-6(1∶400)、MCP-1(1∶1200)、TNF-α(1∶800)、IL-1β(1∶2500)、ICAM-1(1∶800)、STAT3(1∶800)、P-STAT3(P Ser727，1∶800)及SOCS3(1∶800)，4℃冰箱中过夜孵育，TBST缓冲液冲洗硝酸纤维素膜10 min×3次。滴加稀释度为1∶2000的驴抗羊二抗辣根过氧化物酶(HRP)，室温孵育1 h，TBST缓冲液洗膜10 min×3次。按照ECL发光试剂盒说明书要求在暗室内发光曝光。应用图像分析处理软件Glyo Bandscan 4.3分析相应的目的蛋白和内参电泳条带的灰度值，目的蛋白相对表达水平等于目的蛋白条带灰度值与样本GAPDH灰度值的比值。
1.3 统计学方法
应用SPSS 17.0统计软件处理数据，计量资料数据均以均数±标准差(x±s)表示 ......
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