E3泛素连接酶对卵巢癌细胞系SKOV3/DDP顺铂耐药性的影响(1)
[摘要] 目的 探讨E3泛素连接酶(EDD)基因在SKOV3/DDP细胞顺铂耐药中的作用。 方法 采用RT-PCR和Western blot检测人卵巢癌SKOV3细胞和SKOV3/DDP细胞内EDD表达水平的差异。通过转染EDD-siRNA沉默EDD的表达后，噻唑蓝法检测顺铂对SKOV3/DDP细胞增殖的影响，Annexin V-FITC/PI双染法检测顺铂对细胞凋亡的影响；Western blotting检测髓样细胞白血病-1(Mcl-1)和细胞周期检测点激酶2(CHK2)蛋白表达水平。 结果 SKOV3细胞EDD的表达水平显著低于卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP(P < 0.05)。EDD-siRNA转染24 h后，EDD mRNA和蛋白表达水平均显著低于未转染组(P < 0.05)；SKOV3/DDP细胞IC50值显著降低(P < 0.05)，Mcl-1蛋白的表达受到抑制(P < 0.05)，而CHK2无明显变化(P > 0.05)。 结论 EDD-siRNA能沉默EDD基因，降低Mcl-1蛋白的表达水平，增强顺铂对SKOV3/DDP细胞的促凋亡作用，降低SKOV3/DDP细胞对顺铂的耐药性，有效恢复SKOV3/DDP细胞顺铂敏感性。
, 百拇医药
[关键词] EDD；卵巢癌；顺铂耐药；细胞凋亡
[中图分类号] R737.31 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2015)09(b)-0020-05
卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，其最主要的治疗策略是肿瘤细胞减灭术联合铂类药物为基础的化疗法，然而铂类耐药的形成是目前肿瘤治疗过程中的主要障碍之一，因此，研究卵巢癌细胞的耐药机制对卵巢癌提供新的治疗方法具有十分重要的作用。E3泛素连接酶(E3 isolated by differential display，EDD)包括一个羟基末端的连接酶(HECT)泛素连接酶域，是果蝇肿瘤抑制因子hyd的人同源因子[1]，位于染色体8q22.3上，这个染色体区域通常与顺铂耐药具有一定的联系[2]。EDD在卵巢癌、乳腺癌和胃癌中均存在过表达的现象[3-6]，高表达的EDD蛋白可作用于钙整合素结合蛋白1和细胞周期检测点激酶2(checkpoint kinase 2，CHK2)，上调DNA损伤通路相关基因的表达，增强DNA损伤修复能力，增加顺铂等化疗药物的耐药性[7-9]，DNA损伤通路的大部分基因与铂类等化疗药物敏感性降低之间有一定的联系[10]。本研究旨在通过转染EDD-siRNA沉默EDD在耐药细胞SKOV3/DDP的表达，探讨EDD的表达在卵巢癌顺铂耐药形成过程中的作用，并初步探索其相关机制，以期为恢复卵巢癌的顺铂敏感性提供理论基础，为卵巢癌的治疗提供有力的线索。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 细胞及主要试剂
SKOV3、SKOV3/DDP(北京肿瘤医院药物研究所)；胎牛血清(FBS)、RPMI 1640(美国Gibco)；四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)和胰蛋白酶(美国Sigma)；顺铂(齐鲁制药有限公司)；RNA提取试剂盒(美国Invitrogen)；逆转录试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]；SsoFastTM EvaGreen Supermix (BIO-RAD)；RIPA细胞裂解液及BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；EDD抗体、2CHK2抗体、髓样细胞白血病-1(Mcl-1)抗体和兔抗β-actin抗体(上海艾碧康生物制品有限公司)；Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(美国Invitrogen)；EDD-siRNA(5'-CCAUUUACCCUGGCUAGUA-3'，美国Sigma-Aldrich)；非特异性siRNA序列(5'-CUGGAGUUGUCCCAAUUCU-3'，Ambion)；细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)。
, 百拇医药
1.2 细胞培养
将SKOV3和SKOV3/DDP细胞各5×104个培养在含10% FBS的RPMI 1640培养基中，在37℃ 5%CO2的饱和湿度条件下培养。每3天传代1次，取对数生长期细胞进行相关实验。
1.3 RNA干扰
siRNA转染SKOV3/DDP细胞步骤按照Lipofectamine RNAiMAX转染试剂说明书进行。转染后培养24 h，实验分为4组细胞：SKOV3细胞，SKOV3/DDP细胞，SKOV3/DDP细胞+非特异性siRNA(NC siRNA)和SKOV3/DDP细胞+EDD-siRNA。
1.4 RT-PCR检测EDD mRNA的表达
按试剂盒说明提取细胞中RNA并进行逆转录和PCR扩增。EDD mRNA上游引物：5'-TTAGGCTTTTGGTAAATGGCTGCG-3'，下游引物：5'-TGAGGGCATAGGCTGGAATCCTTC-3'。内参GAPDH上游引物：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。PCR扩增反应体系(10 μL)为：上下游引物各2 μL，5 μL SsoFastTM EvaGreen Supermix，1 μL cDNA；反应条件：94℃ 4 min，94℃ 20 s，55℃ 30 s，72℃ 20 s，共35个循环，72℃ 10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖电泳鉴定。试验重复3次，每次5个复孔。
1.5 Western blotting检测蛋白表达
提取细胞蛋白并测量蛋白浓度，Western blot检测EDD、CHK2以及Mcl-1蛋白表达。以β-actin为内参，每组上样量50 μg，一抗(1∶400稀释)温室孵育2 h，二抗(1∶2000稀释)孵育1.5 h，DAB显色，暗室曝光。试验重复3次，每次5个复孔。, 百拇医药(王小特 曹怡)
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[关键词] EDD；卵巢癌；顺铂耐药；细胞凋亡
[中图分类号] R737.31 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2015)09(b)-0020-05
卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，其最主要的治疗策略是肿瘤细胞减灭术联合铂类药物为基础的化疗法，然而铂类耐药的形成是目前肿瘤治疗过程中的主要障碍之一，因此，研究卵巢癌细胞的耐药机制对卵巢癌提供新的治疗方法具有十分重要的作用。E3泛素连接酶(E3 isolated by differential display，EDD)包括一个羟基末端的连接酶(HECT)泛素连接酶域，是果蝇肿瘤抑制因子hyd的人同源因子[1]，位于染色体8q22.3上，这个染色体区域通常与顺铂耐药具有一定的联系[2]。EDD在卵巢癌、乳腺癌和胃癌中均存在过表达的现象[3-6]，高表达的EDD蛋白可作用于钙整合素结合蛋白1和细胞周期检测点激酶2(checkpoint kinase 2，CHK2)，上调DNA损伤通路相关基因的表达，增强DNA损伤修复能力，增加顺铂等化疗药物的耐药性[7-9]，DNA损伤通路的大部分基因与铂类等化疗药物敏感性降低之间有一定的联系[10]。本研究旨在通过转染EDD-siRNA沉默EDD在耐药细胞SKOV3/DDP的表达，探讨EDD的表达在卵巢癌顺铂耐药形成过程中的作用，并初步探索其相关机制，以期为恢复卵巢癌的顺铂敏感性提供理论基础，为卵巢癌的治疗提供有力的线索。
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1.1 细胞及主要试剂
SKOV3、SKOV3/DDP(北京肿瘤医院药物研究所)；胎牛血清(FBS)、RPMI 1640(美国Gibco)；四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)和胰蛋白酶(美国Sigma)；顺铂(齐鲁制药有限公司)；RNA提取试剂盒(美国Invitrogen)；逆转录试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]；SsoFastTM EvaGreen Supermix (BIO-RAD)；RIPA细胞裂解液及BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；EDD抗体、2CHK2抗体、髓样细胞白血病-1(Mcl-1)抗体和兔抗β-actin抗体(上海艾碧康生物制品有限公司)；Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(美国Invitrogen)；EDD-siRNA(5'-CCAUUUACCCUGGCUAGUA-3'，美国Sigma-Aldrich)；非特异性siRNA序列(5'-CUGGAGUUGUCCCAAUUCU-3'，Ambion)；细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)。
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1.2 细胞培养
将SKOV3和SKOV3/DDP细胞各5×104个培养在含10% FBS的RPMI 1640培养基中，在37℃ 5%CO2的饱和湿度条件下培养。每3天传代1次，取对数生长期细胞进行相关实验。
1.3 RNA干扰
siRNA转染SKOV3/DDP细胞步骤按照Lipofectamine RNAiMAX转染试剂说明书进行。转染后培养24 h，实验分为4组细胞：SKOV3细胞，SKOV3/DDP细胞，SKOV3/DDP细胞+非特异性siRNA(NC siRNA)和SKOV3/DDP细胞+EDD-siRNA。
1.4 RT-PCR检测EDD mRNA的表达
按试剂盒说明提取细胞中RNA并进行逆转录和PCR扩增。EDD mRNA上游引物：5'-TTAGGCTTTTGGTAAATGGCTGCG-3'，下游引物：5'-TGAGGGCATAGGCTGGAATCCTTC-3'。内参GAPDH上游引物：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。PCR扩增反应体系(10 μL)为：上下游引物各2 μL，5 μL SsoFastTM EvaGreen Supermix，1 μL cDNA；反应条件：94℃ 4 min，94℃ 20 s，55℃ 30 s，72℃ 20 s，共35个循环，72℃ 10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖电泳鉴定。试验重复3次，每次5个复孔。
1.5 Western blotting检测蛋白表达
提取细胞蛋白并测量蛋白浓度，Western blot检测EDD、CHK2以及Mcl-1蛋白表达。以β-actin为内参，每组上样量50 μg，一抗(1∶400稀释)温室孵育2 h，二抗(1∶2000稀释)孵育1.5 h，DAB显色，暗室曝光。试验重复3次，每次5个复孔。, 百拇医药(王小特 曹怡)