1.6 免疫印迹(Western blot)分析PI3K、AKT、Bcl-2以及Bax蛋白的表达

    将各组细胞培养瓶置于冰上，PBS洗涤细胞3次，每个培养瓶中加入适量细胞裂解液，超声裂解组织，每次工作20 s，间歇30 s，反复5次，之后放置冰上裂解30 min，13 500 r/min高速离心机于4℃条件下离心15 min，收集上清液于-80℃冰箱中保存。取1 μL樣品应用BCA试剂盒测定细胞中蛋白质浓度。依次配制分离胶和积层胶，每个孔道中加入80～100 μg的样品量。电泳槽联通电泳仪电源，90V电压跑浓缩胶。待测样品和进入分离胶后，电压改为120V，电泳60～90 min后，溴酚蓝快迁移出分离胶时停止电泳。按照“纤维垫-滤纸-凝胶-硝化纤维膜-滤纸-纤维垫”的顺序由下至上排列安装好，恒定300 mA电流，转膜时间为80 min。取出NC膜置于5%的脱脂奶粉中，在4℃的环境中封闭2 h。分别用一抗PI3K抗体(1∶200)、AKT(1∶500)、p-AKT(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、GAPDH(1∶1000)在4℃冰箱中孵育过夜 ......