蒙药材玉簪花指纹图谱研究
近年来关于玉簪花质量标准的研究，有关于总多糖、总黄酮、山奈酚、甾体化合物及总黄酮的含量测定的报道[6-11]，但对玉簪花药材指纹图谱的研究报道仍然较少。因此，基于目前对玉簪花所含主要成分、定性定量分析方法、指纹图谱质量控制方法、质量标准规范要求等仍不完善这一现状，本研究采用高效液相色谱(HPLC)法建立了玉簪花药材的指纹图谱分析方法，并对不同批次玉簪花药材的质量进行系统的比较研究，以便更好地进行玉簪花质量控制，为建立玉簪花法定药材质量标准奠定基础[12]。
1 仪器与试药
1.1 仪器
岛津CBM-10A VP plus HPLC仪；奥泰800型蒸发光检测器；LC Solutionlite色谱工作站。電子天平(上海越平科学仪器有限公司)；鼓风式干燥箱(上海分析仪器厂)。
1.2 样品及试剂
甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)购买于Merck，Germany，超纯水，山萘酚(100081-200406，中国药品生物制品检定研究所)，其他试剂均为分析纯。
玉簪花1、2、3批(购于亳州市飒枫药业)；玉簪花4、5、6批(购于亳州荣华堂中药材采购站)；玉簪花7、8、9、10批(购于安国市荣草药材行)，经内蒙古医科大学中药鉴定教研室渠弼教授鉴定为百合科植物玉簪的干燥花。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备
精密称取玉簪花药材粉末0.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，超声(25 kHz)提取40 min，放冷至室温，并用甲醇补足重量，溶液用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，摇匀，取一定量的甲醇提取液续滤液，即得。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取在60℃减压干燥4 h至恒重的山奈酚对照品1.00 mg，至10 mL的容量瓶中，加甲醇制成每毫升含100 μg山奈酚的溶液，即得。
2.3 色谱条件
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱：Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相为甲醇(A)-0.5%磷酸溶液(B)(线形梯度)按表1程序进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温为30℃，检测波长256 nm。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度考察 精密吸取玉簪花药材供试品溶液10 μL，依给定色谱条件重复进样5次，测定其HPLC图谱。考察选出的18个共有指纹峰，以6号峰为参照峰。结果表明：各共有峰的相对保留时间的RSD(RT)值<1%，相对峰面积比值的RSD值分别在RSD(RA)值<3%，表明仪器等整个检测系统的精密度良好。
2.4.2 重复性考察 取同一个批次的玉簪花样品5份，按“2.1”步骤操作，通过HPLC分析5份玉簪花药材供试品溶液，结果表明：各共有峰的相对保留时间的RSD(RT)值<2%，相对峰面积比值的RSD值分别在RSD(RA)值<5%，表明该方法的重复性良好。
2.4.3 稳定性考察 取新鲜制备的玉簪花供试品溶液，按“2.3”项下的色谱条件，分别在0、6、12、24、48 h进样10 μL，结果显示，通过HPLC分析玉簪花药材供试品溶液，结果表明：上述各色谱峰各共有峰的相对保留时间的RSD(RT)值<2%，相对峰面积比值的RSD值分别在RSD(RA)值<3%，表明供试品溶液在48 h内的稳定性良好。
2.5 不同批次药材玉簪花指纹图谱测定
本研究分别取10批次玉簪花药材样品，按照“2.1”项下的方法制备供试品溶液，按照“2.3”项下的条件依次对供试品溶液进样测定，10个批次药材色谱图的叠加图谱见图1，其中有18个峰特征显著，重现性好，因此确定这18个峰为指纹图谱的共有指纹峰。根据10批玉簪花药材指纹图谱的检测结果[共有指纹峰相对保留时间(RT)和相对峰面积(RA)]，采用国家药典委员会编写的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2010年2.0版)以中位数法生成标准指纹图谱(见图1)。在图1中，6号峰为参照物(山奈酚)峰。结果表明，10批不同产地的玉簪花相似度值均>0.9，结果见表2。
3 讨论
3.1 检测波长考察
玉簪花主要含有皂苷类、黄酮类及香豆素类成分，实验中同时选定了256、295、340 nm 3个波长进行检测。又因供试品和对照品溶液经200～400 nm全波长扫描，溶液在256 nm处均呈现最大吸收，故实验中选定了256 nm为检测波长。
3.2 流动相选择
选择流动相时，为使各成分分离完全，相对保留时间稳定，出峰时间短，本研究中采用梯度洗脱的方法，分别以甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-冰醋酸等不同体积分数、不同比例的流动相系统进行等度和梯度洗脱试验。结果表明：采用甲醇(A)-0.5%磷酸溶液(B)进行梯度洗脱为佳，峰形尖锐且分离度较好，流动相在不同时间洗脱比例时，各峰的保留时间适中，且基线较平稳，不易漂移。考虑到线性梯度洗脱程序简单、操作容易、具有普遍适用性的特点，并能有效的提高色谱图的分离度，因此选择上述流动相条件进行线性洗脱。鉴于玉簪花中化学成分复杂，为避免色谱峰拖尾，因此流动相加入酸，既可以有效避免了色谱图的拖尾现象，又有利于指纹图谱的分析。
3.3 提取溶剂及方法的考察
3.3.1 提取溶剂的考察 取玉簪花药材粉末1 g，共6份，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇各20 mL，称重，超声处理40 min，取出，放冷，称重。分别用相应的溶剂补足失重，过滤，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。分别考察HPLC指纹图谱，经过对出峰个数及分离度等的综合比较，确定甲醇为适宜的提取溶剂。, 百拇医药(李慧芳 王敏杰 朱贺年)
1 仪器与试药
1.1 仪器
岛津CBM-10A VP plus HPLC仪；奥泰800型蒸发光检测器；LC Solutionlite色谱工作站。電子天平(上海越平科学仪器有限公司)；鼓风式干燥箱(上海分析仪器厂)。
1.2 样品及试剂
甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)购买于Merck，Germany，超纯水，山萘酚(100081-200406，中国药品生物制品检定研究所)，其他试剂均为分析纯。
玉簪花1、2、3批(购于亳州市飒枫药业)；玉簪花4、5、6批(购于亳州荣华堂中药材采购站)；玉簪花7、8、9、10批(购于安国市荣草药材行)，经内蒙古医科大学中药鉴定教研室渠弼教授鉴定为百合科植物玉簪的干燥花。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备
精密称取玉簪花药材粉末0.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，超声(25 kHz)提取40 min，放冷至室温，并用甲醇补足重量，溶液用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，摇匀，取一定量的甲醇提取液续滤液，即得。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取在60℃减压干燥4 h至恒重的山奈酚对照品1.00 mg，至10 mL的容量瓶中，加甲醇制成每毫升含100 μg山奈酚的溶液，即得。
2.3 色谱条件
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱：Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相为甲醇(A)-0.5%磷酸溶液(B)(线形梯度)按表1程序进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温为30℃，检测波长256 nm。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度考察 精密吸取玉簪花药材供试品溶液10 μL，依给定色谱条件重复进样5次，测定其HPLC图谱。考察选出的18个共有指纹峰，以6号峰为参照峰。结果表明：各共有峰的相对保留时间的RSD(RT)值<1%，相对峰面积比值的RSD值分别在RSD(RA)值<3%，表明仪器等整个检测系统的精密度良好。
2.4.2 重复性考察 取同一个批次的玉簪花样品5份，按“2.1”步骤操作，通过HPLC分析5份玉簪花药材供试品溶液，结果表明：各共有峰的相对保留时间的RSD(RT)值<2%，相对峰面积比值的RSD值分别在RSD(RA)值<5%，表明该方法的重复性良好。
2.4.3 稳定性考察 取新鲜制备的玉簪花供试品溶液，按“2.3”项下的色谱条件，分别在0、6、12、24、48 h进样10 μL，结果显示，通过HPLC分析玉簪花药材供试品溶液，结果表明：上述各色谱峰各共有峰的相对保留时间的RSD(RT)值<2%，相对峰面积比值的RSD值分别在RSD(RA)值<3%，表明供试品溶液在48 h内的稳定性良好。
2.5 不同批次药材玉簪花指纹图谱测定
本研究分别取10批次玉簪花药材样品，按照“2.1”项下的方法制备供试品溶液，按照“2.3”项下的条件依次对供试品溶液进样测定，10个批次药材色谱图的叠加图谱见图1，其中有18个峰特征显著，重现性好，因此确定这18个峰为指纹图谱的共有指纹峰。根据10批玉簪花药材指纹图谱的检测结果[共有指纹峰相对保留时间(RT)和相对峰面积(RA)]，采用国家药典委员会编写的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2010年2.0版)以中位数法生成标准指纹图谱(见图1)。在图1中，6号峰为参照物(山奈酚)峰。结果表明，10批不同产地的玉簪花相似度值均>0.9，结果见表2。
3 讨论
3.1 检测波长考察
玉簪花主要含有皂苷类、黄酮类及香豆素类成分，实验中同时选定了256、295、340 nm 3个波长进行检测。又因供试品和对照品溶液经200～400 nm全波长扫描，溶液在256 nm处均呈现最大吸收，故实验中选定了256 nm为检测波长。
3.2 流动相选择
选择流动相时，为使各成分分离完全，相对保留时间稳定，出峰时间短，本研究中采用梯度洗脱的方法，分别以甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-冰醋酸等不同体积分数、不同比例的流动相系统进行等度和梯度洗脱试验。结果表明：采用甲醇(A)-0.5%磷酸溶液(B)进行梯度洗脱为佳，峰形尖锐且分离度较好，流动相在不同时间洗脱比例时，各峰的保留时间适中，且基线较平稳，不易漂移。考虑到线性梯度洗脱程序简单、操作容易、具有普遍适用性的特点，并能有效的提高色谱图的分离度，因此选择上述流动相条件进行线性洗脱。鉴于玉簪花中化学成分复杂，为避免色谱峰拖尾，因此流动相加入酸，既可以有效避免了色谱图的拖尾现象，又有利于指纹图谱的分析。
3.3 提取溶剂及方法的考察
3.3.1 提取溶剂的考察 取玉簪花药材粉末1 g，共6份，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇各20 mL，称重，超声处理40 min，取出，放冷，称重。分别用相应的溶剂补足失重，过滤，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。分别考察HPLC指纹图谱，经过对出峰个数及分离度等的综合比较，确定甲醇为适宜的提取溶剂。, 百拇医药(李慧芳 王敏杰 朱贺年)