1.2 研究方法

    选择T-SPOT.TB(Oxford Immunotec Ltd)作为试剂盒，并严格按照操作说明完成相关操作。以肝素抗凝真空采血管采集患者4 mL的外周静脉血后行外周血单个核细胞分离，并制备成浓度为2.5×106个/mL的單个核细胞悬液。将50 μL细胞培养液加入到空白对照孔，将50 μL抗原B加入至检测孔B(抗原CFP-10)和加入50 μL抗原A至检测孔A(抗原ESAT-6)加入50 μL阳性对照至阳性对照孔(植物血凝素PHA)，在预包被好γ-干扰素抗体的平板中，然后每孔依次加入100 μL浓度为2.5×106个/mL的单个核细胞悬液。放入CO2培养箱(37℃，5%CO2)培养16～20 h。根据标本量先计算好酶结合物工作液所需的量，以1∶200的比例将酶结合物原液与PBS液混合，制成酶结合物工作液，每孔加50 μL，4～8℃孵育1 h。每孔用200 μL PBS液洗涤4次，拍干，然后加显色液50 μL，暗处静置7 min，用蒸馏水终止反应。将板孔内液体拍干，晾至底膜干透后行斑点形成细胞个数(spot forming cells，SFCs)读取并记录结果。结果判定依照TSPOT-TB使用说明书进行。阳性结果判断标准：空白对照孔斑点数为0～5个时且抗原A或抗原B孔的斑点数-空白对照孔斑点数≥6；空白对照孔斑点数为6～10个时且抗原A或抗原B孔的斑点数≥2×空白对照孔斑点数 ......