DNAzymes针对Ezrin mRNA的反义技术靶点筛选及验证(2)
1 对象与方法1.1 研究对象
自GenBank数据库筛选出编码为X51521.1的人类Ezrin蛋白mRNA全长序列，在其中获取3044个碱基编码Ezrin蛋白的基因。通过RNAstructure与RNAdraw程序分析Ezrin mRNA结构，分析计算其一、二级结构的相关信息。两种程序同时计算出碱基未配对的单链成环区，且连续存在4个以上，则将其设为反义技术的靶区域，在此区域内设计DNAzymes的作用靶点，再依据最低自由能原则，运用计算机中的OligoWalk程序进行筛选，以此方式得到各反义技术的作用靶点，筛选结果为AU1655、AU1751、AU1766以及AU1789。
1.2 细胞培养及DNAzymes合成
人成骨肉瘤耐药细胞系MG63/DOX(100万细胞数)购买自上海酶研生物公司，将细胞置于DMEM培养液中，加入10%小牛血清，37℃培养使其贴壁生长，每隔6 h观察1次，至细胞90%融合后，取出，严格按照说明书提取RNA。Trizol总RNA抽提试剂盒购自上海沪峰化工有限公司。DNAzymes委托上海生工公司合成。与RNA提取试剂盒提取总RNA后 ......
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