PCR-RFLP法检测DDAH2基因rs805304多态性的实验条件研究(1)
[摘要] 目的 探讨聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测二甲基精氨酸二甲胺水解酶2(DDAH2)rs805304多态性的最适实验条件。 方法 运用PCR-RFLP技术分别对2016年1月～2017年3月昆明医科大学第一附属医院收治的182例2型糖尿病患者和147名健康体检者DDAH2基因rs805304的多态性进行检测，对影响PCR-RFLP方法的主要因素进行研究。 结果 最适实验条件：退火温度为58℃，变性温度为95℃，2× Power Taq PCR Master Mix浓度为12.5 μL，引物浓度为0.8 μmo/L，酶切体系为15 μL体系中加8.0 μL产物，用5 U的限制性内切酶BstUI消化。 结论 最适实验条件的摸索为后续研究奠定了基础。
[关键词] 聚合酶链反应;限制性片段长度多态性;二甲基精氨酸二甲胺水解酶2;实验条件
[中图分类号] Q346.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2019)01(b)-0004-04
[Abstract] Objective To investigate the optimum experimental conditions for dimethylarginine dimethylamine hydrolase 2 (DDAH2) gene rs805304 polymorphism by polymerase chain reaction - restricted fragment length polymorphism (PCR-RFLP). Methods The DDAH2-rs805304 locus polymorphism in 182 T2DM cases admitted to the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University from January 2016 to March 2017 and 147 healthy controls were detected by PCR-RFLP. The main factors influencing PCR-RFLP were studied. Results The optimum conditions： annealing temperature was 58℃， denaturation temperature was 95℃， 2× Power Taq PCR Master Mix concentration was 12.5 μL， primer concentration was 0.8 μmo/L， the effective system was 15 μL including 8 μL DNA solution and 5 U restriction enzyme BstUI. Conclusion The exploration of optimal experimental conditions has laid a foundation for the subsequent research.
[Key words] Polymerase chain reaction; Restricted fragment length polymorphism; Dimethylarginine dimethylamine hydrolase 2; Experimental condition
糖尿病發病率急剧增加，2017年全世界大约有4.25亿人患有糖尿病[1]，其危害主要来源于其血管并发症。非对称性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)被认为是内源性一氧化氮合成酶(NOS)抑制剂，人体绝大多数ADMA被二甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethylarginine dimethylamine hydrolase，DDAH)代谢灭活。因此，通过抑制DDAH酶活性，可影响ADMA浓度，从而抑制NOS活性，减少一氧化氮的生成，促使血管内皮功能受损，介导糖尿病动脉粥样硬化的发生发展[2]。国内外学者发现DDAH/ADMA/NOS通路下调与胰岛素抵抗相关[3-4]，该途径还参与糖尿病中内皮细胞的衰老[5-6]。遗传因素可能影响体内DDAH活性，从而导致体内ADMA含量的改变[7-10]。近期研究提示DDAH2过度表达及其基因多态性可能与高血压、胰岛素抵抗相关[11-15]。然而DDAH2基因是否参与糖尿病血管并发症的发生，目前尚不清楚。本研究对聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测该基因位点多态性的最适实验条件进行系统研究。
1 材料与方法
1.1 实验对象
1.1.1 2型糖尿病患者 选取2016年1月～2017年3月于昆明医科大学第一附属医院(以下简称“我院”)糖尿病科住院部的云南地区汉族患者，根据1999年WHO诊断标准确诊的无亲缘关系同时排除合并急性代谢紊乱、感染、严重肝肾功能不全、妊娠及其他内分泌系统疾病的2型糖尿病患者182例，男93例，女89例，平均年龄(55.03±11.45)岁。
1.1.2 正常对照 选取同时期在我院进行健康体检的无亲缘关系的云南地区汉族人群，无糖尿病、高血压家族史，且糖耐量及其他检查结果均正常者为健康对照者，共147名，男75名，女72名，平均年龄(52.15±11.82)岁。
1.2 主要试剂
全血基因组DNA提取试剂盒(上海生工生物有限公司，B518223)，2× Power Taq PCR Master Mix(百泰克公司，pr1701)，由上海生工生物有限公司根据人DDAH2基因组DNA序列，应用Primer软件设计并合成PCR用的引物：上游5′-AGAGGGGATGAGGGAA-AGAA-3′，下游5′-CCTTGTGTAGGCGAGCTCAT-3′，限制性内切酶BstUI(New England Biolabs公司，R0518V)。, 百拇医药(石柔 董荣静 刘华 李会芳)
[关键词] 聚合酶链反应;限制性片段长度多态性;二甲基精氨酸二甲胺水解酶2;实验条件
[中图分类号] Q346.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2019)01(b)-0004-04
[Abstract] Objective To investigate the optimum experimental conditions for dimethylarginine dimethylamine hydrolase 2 (DDAH2) gene rs805304 polymorphism by polymerase chain reaction - restricted fragment length polymorphism (PCR-RFLP). Methods The DDAH2-rs805304 locus polymorphism in 182 T2DM cases admitted to the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University from January 2016 to March 2017 and 147 healthy controls were detected by PCR-RFLP. The main factors influencing PCR-RFLP were studied. Results The optimum conditions： annealing temperature was 58℃， denaturation temperature was 95℃， 2× Power Taq PCR Master Mix concentration was 12.5 μL， primer concentration was 0.8 μmo/L， the effective system was 15 μL including 8 μL DNA solution and 5 U restriction enzyme BstUI. Conclusion The exploration of optimal experimental conditions has laid a foundation for the subsequent research.
[Key words] Polymerase chain reaction; Restricted fragment length polymorphism; Dimethylarginine dimethylamine hydrolase 2; Experimental condition
糖尿病發病率急剧增加，2017年全世界大约有4.25亿人患有糖尿病[1]，其危害主要来源于其血管并发症。非对称性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)被认为是内源性一氧化氮合成酶(NOS)抑制剂，人体绝大多数ADMA被二甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethylarginine dimethylamine hydrolase，DDAH)代谢灭活。因此，通过抑制DDAH酶活性，可影响ADMA浓度，从而抑制NOS活性，减少一氧化氮的生成，促使血管内皮功能受损，介导糖尿病动脉粥样硬化的发生发展[2]。国内外学者发现DDAH/ADMA/NOS通路下调与胰岛素抵抗相关[3-4]，该途径还参与糖尿病中内皮细胞的衰老[5-6]。遗传因素可能影响体内DDAH活性，从而导致体内ADMA含量的改变[7-10]。近期研究提示DDAH2过度表达及其基因多态性可能与高血压、胰岛素抵抗相关[11-15]。然而DDAH2基因是否参与糖尿病血管并发症的发生，目前尚不清楚。本研究对聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测该基因位点多态性的最适实验条件进行系统研究。
1 材料与方法
1.1 实验对象
1.1.1 2型糖尿病患者 选取2016年1月～2017年3月于昆明医科大学第一附属医院(以下简称“我院”)糖尿病科住院部的云南地区汉族患者，根据1999年WHO诊断标准确诊的无亲缘关系同时排除合并急性代谢紊乱、感染、严重肝肾功能不全、妊娠及其他内分泌系统疾病的2型糖尿病患者182例，男93例，女89例，平均年龄(55.03±11.45)岁。
1.1.2 正常对照 选取同时期在我院进行健康体检的无亲缘关系的云南地区汉族人群，无糖尿病、高血压家族史，且糖耐量及其他检查结果均正常者为健康对照者，共147名，男75名，女72名，平均年龄(52.15±11.82)岁。
1.2 主要试剂
全血基因组DNA提取试剂盒(上海生工生物有限公司，B518223)，2× Power Taq PCR Master Mix(百泰克公司，pr1701)，由上海生工生物有限公司根据人DDAH2基因组DNA序列，应用Primer软件设计并合成PCR用的引物：上游5′-AGAGGGGATGAGGGAA-AGAA-3′，下游5′-CCTTGTGTAGGCGAGCTCAT-3′，限制性内切酶BstUI(New England Biolabs公司，R0518V)。, 百拇医药(石柔 董荣静 刘华 李会芳)