柚皮苷和柚皮素对克拉霉素经大鼠肝微粒体代谢的影响(3)
1.3.7 柚皮苷和柚皮素对克拉霉素在大鼠肝微粒体中代谢的影响
采用一系列浓度的柚皮苷和柚皮素溶液(180.00、90.00、30.00、10.00、3.30、1.10、0.33及0.11 μmol/L)与克拉霉素溶液进行共孵育60 min后，按“1.3.4.2”項下操作，用HPLC测定剩余克拉霉素的含量。另设空白对照，以空白对照组代谢量为100%，计算柚皮苷和柚皮素对克拉霉素经大鼠肝微粒体代谢的相对抑制率。
1.4 统计学方法
采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差(x±s)表示，两组间比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 专属性研究
, http://www.100md.com
在本色谱条件下，克拉霉素的保留时间为12.5 min左右，空白体系在克拉霉素及罗红霉素保留时间内无杂质峰干扰，本检测方法专属性良好。见图1。
2.2 标准曲线和线性范围
结果显示，在5～125 μmol/L的浓度范围内，标准曲线方程为Y = 0.0062 X - 0.0132，R2 = 0.9994。
2.3 准确度、精密度和回收率
在本色谱条件下，测定的克拉霉素含量，准确度及精密度的偏差值均<±15%，回收率均在90%～110%范围内，符合生物样品分析方法的要求。见表1。
2.4 克拉霉素代谢时间-浓度变化
当孵育时间达到60 min，克拉霉素基本达到代谢平台期，符合试验要求。在方法学验证及样品测定试验中，选择60 min作为孵育体系的代谢时间。见表2。
, http://www.100md.com
2.5 克拉霉素酶动力学结果
根据Lineweaver-Burk方程式得到曲线方程为Y = 78195 X+1008(X为底物浓度的倒数，Y为反应速度的倒数，R2 = 0.9947)，Vmax为0.59 nmol/(min·mg)，Km = 77.57 μmol/L。确定80 μmol/L作为克拉霉素的代谢反应的底物浓度。
2.6 柚皮苷和柚皮素对克拉霉素在大鼠肝微粒体中代谢的影响
与空白对照组比较，各剂量组的柚皮苷和柚皮素对克拉霉素在大鼠肝微粒体中的代谢量差异均无统计学意义(P > 0.05)。见表3。
3 讨论
近年来，柚皮苷因其广泛的药理活性而受到关注，大量研究表明，柚皮苷或柚皮素具有抗氧化、抗骨质疏松、改善神经功能障碍、改善糖脂代谢紊乱、抗动脉粥样硬化等药理作用[12-15]。目前，关于柚皮苷对CYP450酶活性的影响，多集中于CYP3A酶，且文献报道的结论不一致。Edwards等[16]的研究显示，葡萄柚汁中抑制CYP3A酶活性的主要成分不是柚皮苷和柚皮素;Kim等[17]的研究显示，柚皮苷可能通过抑制CYP3A酶活性而减少维拉帕米在家兔体内的代谢;Choi等[18]的研究显示，柚皮苷可能通过抑制CYP3A酶活性和P-糖蛋白而提高他莫西芬在大鼠体内的生物利用度。可见，柚皮苷对CYP3A酶活性的影响尚无统一定论。
, http://www.100md.com
克拉霉素在体内主要由CYP3A4酶代谢[10]，也能抑制CYP3A4酶[19]和有机阴离子转运多肽1B1和1B3的活性[20]。目前，关于克拉霉素的药物相互作用方面，大多研究的是克拉霉素对其他药物的影响。
本研究结果显示，在5～125 μmol/L的浓度范围内，标准曲线方程为Y = 0.0062 X - 0.0132，R2 = 0.9994。说明在该线性范围内，克拉霉素的浓度与色谱峰面积之间线性关系良好。在本色谱条件下，测定的克拉霉素含量，准确度及精密度的偏差值均< ±15%，回收率均在90%～110%范围内，符合生物样品分析方法的要求。说明该测定方法的准确性、精密度、回收率良好，适用于该体系克拉霉素的检测。当孵育时间达到60 min，克拉霉素基本达到代谢平台期，符合试验要求。因此，在方法学验证及样品测定试验中，选择60 min作为孵育体系的代谢时间。根据Lineweaver-Burk方程式得到曲线方程为Y = 78195 X + 1008(X为底物浓度的倒数，Y为反应速度的倒数，R2 = 0.9947)，Vmax为0.59 nmol/(min·mg)，Km = 77.57 μmol/L。因此，确定80 μmol/L作为克拉霉素的代谢反应的底物浓度。柚皮苷和柚皮素浓度0.11～180 μmol/L的范围内对克拉霉素在大鼠肝微粒体中的代谢无明显影响。提示柚皮苷和柚皮素不影响克拉霉素在大鼠肝微粒体中的代谢。
, http://www.100md.com
[参考文献]
[1] Zeng X，Su W，Zheng Y，et al. Pharmacokinetics，tissue distribution，metabolism，and excretion of naringin in aged rats [J]. Front Pharmacol，2019，10：34.
[2] Zou W，Luo Y，Liu M，et al. Human intestinal microbial metabolism of naringin [J]. Eur J Drug Metab Pharmacokinet，2015，40(3)：363-367.
[3] Gao S，Li P，Yang H，et al. Antitussive effect of naringin on experimentally-induced cough in guinea pigs [J]. Planta Med，2011，77(1)：16-21.
[4] Luo YL，Zhang CC，Li PB，et al. Naringin attenuates enhanced cough，airway hyperresponsiveness and airway inflammation in a guinea pig model of chronic bronchitis induced by cigarette smoke [J]. Int Immunopharmacol，2012， 13(3)：301-307., 百拇医药(谢镗宁 苏薇薇 王永刚 吴灏 彭维 李沛波)
采用一系列浓度的柚皮苷和柚皮素溶液(180.00、90.00、30.00、10.00、3.30、1.10、0.33及0.11 μmol/L)与克拉霉素溶液进行共孵育60 min后，按“1.3.4.2”項下操作，用HPLC测定剩余克拉霉素的含量。另设空白对照，以空白对照组代谢量为100%，计算柚皮苷和柚皮素对克拉霉素经大鼠肝微粒体代谢的相对抑制率。
1.4 统计学方法
采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差(x±s)表示，两组间比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 专属性研究
, http://www.100md.com
在本色谱条件下，克拉霉素的保留时间为12.5 min左右，空白体系在克拉霉素及罗红霉素保留时间内无杂质峰干扰，本检测方法专属性良好。见图1。
2.2 标准曲线和线性范围
结果显示，在5～125 μmol/L的浓度范围内，标准曲线方程为Y = 0.0062 X - 0.0132，R2 = 0.9994。
2.3 准确度、精密度和回收率
在本色谱条件下，测定的克拉霉素含量，准确度及精密度的偏差值均<±15%，回收率均在90%～110%范围内，符合生物样品分析方法的要求。见表1。
2.4 克拉霉素代谢时间-浓度变化
当孵育时间达到60 min，克拉霉素基本达到代谢平台期，符合试验要求。在方法学验证及样品测定试验中，选择60 min作为孵育体系的代谢时间。见表2。
, http://www.100md.com
2.5 克拉霉素酶动力学结果
根据Lineweaver-Burk方程式得到曲线方程为Y = 78195 X+1008(X为底物浓度的倒数，Y为反应速度的倒数，R2 = 0.9947)，Vmax为0.59 nmol/(min·mg)，Km = 77.57 μmol/L。确定80 μmol/L作为克拉霉素的代谢反应的底物浓度。
2.6 柚皮苷和柚皮素对克拉霉素在大鼠肝微粒体中代谢的影响
与空白对照组比较，各剂量组的柚皮苷和柚皮素对克拉霉素在大鼠肝微粒体中的代谢量差异均无统计学意义(P > 0.05)。见表3。
3 讨论
近年来，柚皮苷因其广泛的药理活性而受到关注，大量研究表明，柚皮苷或柚皮素具有抗氧化、抗骨质疏松、改善神经功能障碍、改善糖脂代谢紊乱、抗动脉粥样硬化等药理作用[12-15]。目前，关于柚皮苷对CYP450酶活性的影响，多集中于CYP3A酶，且文献报道的结论不一致。Edwards等[16]的研究显示，葡萄柚汁中抑制CYP3A酶活性的主要成分不是柚皮苷和柚皮素;Kim等[17]的研究显示，柚皮苷可能通过抑制CYP3A酶活性而减少维拉帕米在家兔体内的代谢;Choi等[18]的研究显示，柚皮苷可能通过抑制CYP3A酶活性和P-糖蛋白而提高他莫西芬在大鼠体内的生物利用度。可见，柚皮苷对CYP3A酶活性的影响尚无统一定论。
, http://www.100md.com
克拉霉素在体内主要由CYP3A4酶代谢[10]，也能抑制CYP3A4酶[19]和有机阴离子转运多肽1B1和1B3的活性[20]。目前，关于克拉霉素的药物相互作用方面，大多研究的是克拉霉素对其他药物的影响。
本研究结果显示，在5～125 μmol/L的浓度范围内，标准曲线方程为Y = 0.0062 X - 0.0132，R2 = 0.9994。说明在该线性范围内，克拉霉素的浓度与色谱峰面积之间线性关系良好。在本色谱条件下，测定的克拉霉素含量，准确度及精密度的偏差值均< ±15%，回收率均在90%～110%范围内，符合生物样品分析方法的要求。说明该测定方法的准确性、精密度、回收率良好，适用于该体系克拉霉素的检测。当孵育时间达到60 min，克拉霉素基本达到代谢平台期，符合试验要求。因此，在方法学验证及样品测定试验中，选择60 min作为孵育体系的代谢时间。根据Lineweaver-Burk方程式得到曲线方程为Y = 78195 X + 1008(X为底物浓度的倒数，Y为反应速度的倒数，R2 = 0.9947)，Vmax为0.59 nmol/(min·mg)，Km = 77.57 μmol/L。因此，确定80 μmol/L作为克拉霉素的代谢反应的底物浓度。柚皮苷和柚皮素浓度0.11～180 μmol/L的范围内对克拉霉素在大鼠肝微粒体中的代谢无明显影响。提示柚皮苷和柚皮素不影响克拉霉素在大鼠肝微粒体中的代谢。
, http://www.100md.com
[参考文献]
[1] Zeng X，Su W，Zheng Y，et al. Pharmacokinetics，tissue distribution，metabolism，and excretion of naringin in aged rats [J]. Front Pharmacol，2019，10：34.
[2] Zou W，Luo Y，Liu M，et al. Human intestinal microbial metabolism of naringin [J]. Eur J Drug Metab Pharmacokinet，2015，40(3)：363-367.
[3] Gao S，Li P，Yang H，et al. Antitussive effect of naringin on experimentally-induced cough in guinea pigs [J]. Planta Med，2011，77(1)：16-21.
[4] Luo YL，Zhang CC，Li PB，et al. Naringin attenuates enhanced cough，airway hyperresponsiveness and airway inflammation in a guinea pig model of chronic bronchitis induced by cigarette smoke [J]. Int Immunopharmacol，2012， 13(3)：301-307., 百拇医药(谢镗宁 苏薇薇 王永刚 吴灏 彭维 李沛波)