祛风解痉方调节γδT细胞抑制哮喘小鼠气道高反应性的分子机制(2)
[Key words] Qufeng Jiejing Prescription; Asthma; γδT lymphocyte; Signaling pathway molecules
支气管哮喘(以下简称“哮喘”)是由多种细胞，包括嗜酸粒细胞、中性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、气道上皮细胞等细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病[1]。哮喘主要的免疫学改变是Th1/Th2失衡[2]，也是其发生发展的关键。γδT细胞通过影响Th1/Th2应答平衡而左右哮喘气道高反应性的发生发展，并参与了哮喘的炎症及损伤修复过程，使其与哮喘相关性的研究越来越受到重视[3-6]。
本课题组临床研究证明祛风解痉方可控制哮喘发作，改善气道阻塞，明显改善哮喘患者临床症状，减少急性发作[7-8]。同时课题组前期以卵清蛋白滴鼻的方法建立哮喘小鼠模型，以祛风解痉方药进行干预，比较祛风解痉方药对哮喘模型小鼠肺脏组织病理学、气道高反应、γδT细胞的Vγ1 mRNA、Vγ4 mRNA表达量及γδT细胞分泌的细胞因子白细胞介素-5(IL-5)、IL-13、转化生长因子-β(TGF-β)、IL-10、γ-干扰素(IFN-γ)表达水平的干预效果，发现祛风解痉方药可降低γδT细胞的Vγ1 mRNA表达量、增加Vγ4 mRNA表达量，同时降低γδT细胞分泌的细胞因子IL-5、IL-13、TGF-β表达水平，调高IL-10、IFN-γ的表达水平，抑制气道炎性反应，改善哮喘模型小鼠的气道高反应性，初步阐明了祛风解痉中药调节γδT细胞抑制哮喘小鼠气道高反应性的机制。本研究进一步探讨了祛风解痉中药调节γδT细胞抑制哮喘小鼠气道高反应性的可能的分子机制，为临床应用祛风解痉方药治疗哮喘提供有力的支持及实验数据。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物 6～8周雄性Balb/c小鼠，动物体重35 g，清洁级，温度18～22℃，湿度50%～60%，光照/阴暗12 h/12 h。小鼠购自湖北省动物实验中心，实验动物生产许可证号：31162040001417，动物合格证号SYXK(鄂)2013-0069。动物饲养及取材符合中国中医科学院西苑医院(以下简称“我院”)伦理委员会要求。
1.1.2 试剂及药物 卵清蛋白(OVA)(美国Sigma，货号：A5503-1G);氢氧化铝[AL(OH)3](美国Sigma，货号：V900163-500G);p-ERK1/2(美国Affinity公司，货号：AF1015);ERK1/2(美国Affinity公司，货号：AF0155);p-P38(美国Affinity公司，货号：AF4001);P38(美国Affinity公司，货号：AF6456);β-catenin(美国Affinity公司，货号：AF6266);甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(美国Affinity公司，货号：AF7021);祛风解痉方：炙麻黄9 g、杏仁10 g、防风10 g、地龙12 g、蝉蜕10 g、柴胡9 g、苍耳子6 g、乌梅6 g、陈皮10 g、半夏9 g、茯苓12 g、甘草6 g(我院中药房);醋酸泼尼松片(天津力生制药股份有限公司，批号：1709111，5 mg/片)。
, 百拇医药
1.1.3 主要仪器 台式高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司，H1650R);恒温震荡培养箱(太仓华美生化仪器有限公司，QHZ-12A);电泳仪电泳槽(天能科技有限公司，VE-186);转印槽(Biorad，Trans-Blot SD);脱色摇床(常州澳华仪器有限公司，TS-1);二氧化碳培养箱(日本三洋SANYO，MCO-20AIC);超净工作台(上海博讯，SC-CL-2FD);凝胶成像仪(Biaorad公司，ChemiDoc XRS+System)。
1.2 实验方法
1.2.1 模型制作 在无菌环境中饲养适应1周后，进行第1次致敏，腹腔内注射20 μg OVA和2 mg Al(OH)3;第2、3周后进行第2、3次致敏，腹腔内注射10 μg OVA和1 mg Al(OH)3;第5周开始每天用0.5×磷酸缓冲盐溶液(PBS)配制的5%OVA 40～50 min滴鼻处理。空白对照组致敏用生理盐水，滴鼻处理用0.5×PBS，连续7 d，7 d后评估模型是否成功。
, 百拇医药
1.2.2 模型成功标准 造模后对各组小鼠的气道反应性进行检测。空白对照组小鼠的呼吸波形图规律且均匀，符合正常动物的生理状态。模型组呼吸波形图的上升支和下降支的斜度减小并伴有顿挫，且呼吸周期之间伴有一段时间的基线段。从气道反应性的结果看，在同一浓度的乙酰胆碱下，哮喘模型鼠的气道反应性值高于空白对照组。表明小鼠哮喘模型成功建立，作为后续研究的实验对象。
1.2.3 分组 将30只小鼠按照随机数字表法将其分为6组，每组5只;空白对照组(不造模，给予等体积生理盐水，灌服);模型组对照组(造模后，给予等体积生理盐水，灌服);祛风解痉方低剂量组(造模后，给予1倍量中药，0.59 g/d，灌服);祛风解痉方中剂量组(造模后，给予2倍量中药，1.18 g/d，灌服);祛风解痉方高剂量组(造模后，给予4倍量中药，2.36 g/d，灌服);阳性对照组(造模后，给予1倍量醋酸泼尼松片，0.27 mg/d，灌服)。祛风解痉方按人体每日用药量的1、2、4倍量给药。醋酸泼尼松片(5 mg/片)，成年患者口服10片/d;根据人与小鼠体表面积换算方法计算小鼠给药量，按成年患者用药量的1倍量给药。模型成立后的第2天开始给药，饲料正常给。连续灌胃给药14 d。
1.2.4 肺气道组织γδT细胞的分离纯化及扩增 小鼠麻醉处死后，用无菌手术刀取出各组小鼠肺组织，切碎并用collgenase消化得到的细胞，使用抗TCRγδ磁珠分选，并检测γδT细胞的浓度。将分离纯化的γδT细胞加入50 mL培养瓶中，加入3 mL含10%血清、100 U/mL双抗的RPMI-1640培養基，再加唑来膦酸(终浓度为300 pg/mL)、IL-2(终浓度为200 U/mL)，置于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养，每3天换1次液，培养9～12 d，调整细胞浓度为106/mL。, 百拇医药(樊长征 苗青 洪巧瑜)
支气管哮喘(以下简称“哮喘”)是由多种细胞，包括嗜酸粒细胞、中性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、气道上皮细胞等细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病[1]。哮喘主要的免疫学改变是Th1/Th2失衡[2]，也是其发生发展的关键。γδT细胞通过影响Th1/Th2应答平衡而左右哮喘气道高反应性的发生发展，并参与了哮喘的炎症及损伤修复过程，使其与哮喘相关性的研究越来越受到重视[3-6]。
本课题组临床研究证明祛风解痉方可控制哮喘发作，改善气道阻塞，明显改善哮喘患者临床症状，减少急性发作[7-8]。同时课题组前期以卵清蛋白滴鼻的方法建立哮喘小鼠模型，以祛风解痉方药进行干预，比较祛风解痉方药对哮喘模型小鼠肺脏组织病理学、气道高反应、γδT细胞的Vγ1 mRNA、Vγ4 mRNA表达量及γδT细胞分泌的细胞因子白细胞介素-5(IL-5)、IL-13、转化生长因子-β(TGF-β)、IL-10、γ-干扰素(IFN-γ)表达水平的干预效果，发现祛风解痉方药可降低γδT细胞的Vγ1 mRNA表达量、增加Vγ4 mRNA表达量，同时降低γδT细胞分泌的细胞因子IL-5、IL-13、TGF-β表达水平，调高IL-10、IFN-γ的表达水平，抑制气道炎性反应，改善哮喘模型小鼠的气道高反应性，初步阐明了祛风解痉中药调节γδT细胞抑制哮喘小鼠气道高反应性的机制。本研究进一步探讨了祛风解痉中药调节γδT细胞抑制哮喘小鼠气道高反应性的可能的分子机制，为临床应用祛风解痉方药治疗哮喘提供有力的支持及实验数据。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物 6～8周雄性Balb/c小鼠，动物体重35 g，清洁级，温度18～22℃，湿度50%～60%，光照/阴暗12 h/12 h。小鼠购自湖北省动物实验中心，实验动物生产许可证号：31162040001417，动物合格证号SYXK(鄂)2013-0069。动物饲养及取材符合中国中医科学院西苑医院(以下简称“我院”)伦理委员会要求。
1.1.2 试剂及药物 卵清蛋白(OVA)(美国Sigma，货号：A5503-1G);氢氧化铝[AL(OH)3](美国Sigma，货号：V900163-500G);p-ERK1/2(美国Affinity公司，货号：AF1015);ERK1/2(美国Affinity公司，货号：AF0155);p-P38(美国Affinity公司，货号：AF4001);P38(美国Affinity公司，货号：AF6456);β-catenin(美国Affinity公司，货号：AF6266);甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(美国Affinity公司，货号：AF7021);祛风解痉方：炙麻黄9 g、杏仁10 g、防风10 g、地龙12 g、蝉蜕10 g、柴胡9 g、苍耳子6 g、乌梅6 g、陈皮10 g、半夏9 g、茯苓12 g、甘草6 g(我院中药房);醋酸泼尼松片(天津力生制药股份有限公司，批号：1709111，5 mg/片)。
, 百拇医药
1.1.3 主要仪器 台式高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司，H1650R);恒温震荡培养箱(太仓华美生化仪器有限公司，QHZ-12A);电泳仪电泳槽(天能科技有限公司，VE-186);转印槽(Biorad，Trans-Blot SD);脱色摇床(常州澳华仪器有限公司，TS-1);二氧化碳培养箱(日本三洋SANYO，MCO-20AIC);超净工作台(上海博讯，SC-CL-2FD);凝胶成像仪(Biaorad公司，ChemiDoc XRS+System)。
1.2 实验方法
1.2.1 模型制作 在无菌环境中饲养适应1周后，进行第1次致敏，腹腔内注射20 μg OVA和2 mg Al(OH)3;第2、3周后进行第2、3次致敏，腹腔内注射10 μg OVA和1 mg Al(OH)3;第5周开始每天用0.5×磷酸缓冲盐溶液(PBS)配制的5%OVA 40～50 min滴鼻处理。空白对照组致敏用生理盐水，滴鼻处理用0.5×PBS，连续7 d，7 d后评估模型是否成功。
, 百拇医药
1.2.2 模型成功标准 造模后对各组小鼠的气道反应性进行检测。空白对照组小鼠的呼吸波形图规律且均匀，符合正常动物的生理状态。模型组呼吸波形图的上升支和下降支的斜度减小并伴有顿挫，且呼吸周期之间伴有一段时间的基线段。从气道反应性的结果看，在同一浓度的乙酰胆碱下，哮喘模型鼠的气道反应性值高于空白对照组。表明小鼠哮喘模型成功建立，作为后续研究的实验对象。
1.2.3 分组 将30只小鼠按照随机数字表法将其分为6组，每组5只;空白对照组(不造模，给予等体积生理盐水，灌服);模型组对照组(造模后，给予等体积生理盐水，灌服);祛风解痉方低剂量组(造模后，给予1倍量中药，0.59 g/d，灌服);祛风解痉方中剂量组(造模后，给予2倍量中药，1.18 g/d，灌服);祛风解痉方高剂量组(造模后，给予4倍量中药，2.36 g/d，灌服);阳性对照组(造模后，给予1倍量醋酸泼尼松片，0.27 mg/d，灌服)。祛风解痉方按人体每日用药量的1、2、4倍量给药。醋酸泼尼松片(5 mg/片)，成年患者口服10片/d;根据人与小鼠体表面积换算方法计算小鼠给药量，按成年患者用药量的1倍量给药。模型成立后的第2天开始给药，饲料正常给。连续灌胃给药14 d。
1.2.4 肺气道组织γδT细胞的分离纯化及扩增 小鼠麻醉处死后，用无菌手术刀取出各组小鼠肺组织，切碎并用collgenase消化得到的细胞，使用抗TCRγδ磁珠分选，并检测γδT细胞的浓度。将分离纯化的γδT细胞加入50 mL培养瓶中，加入3 mL含10%血清、100 U/mL双抗的RPMI-1640培養基，再加唑来膦酸(终浓度为300 pg/mL)、IL-2(终浓度为200 U/mL)，置于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养，每3天换1次液，培养9～12 d，调整细胞浓度为106/mL。, 百拇医药(樊长征 苗青 洪巧瑜)