1.2 方法

    1.2.1 目的片段的扩增 提取HepG2细胞总RNA并进行反转录，得到的cDNA作为扩增的模板。设计引物如下，VEGF-upper：5′-CATATGATGGTTGTTAAA-TTCATGGAC-3′，VEGF-lower：5′-CTCGAGGCACAA-CAAATGCGAATGCCGT-3′，两端加入酶切位点NdeI和XhoI，片段长度为279 bp。PCR扩增条件：94℃预变性5 min;95℃变性30 s，56℃复性30 s，72℃延伸30 s，共30个循环;最后72℃延伸5 min。扩增产物经电泳鉴定后胶回收。

    1.2.2 原核表达载体的构建 PCR扩增时保留C端的组氨酸(His)标签用于后续纯化和鉴定。将上述扩增片段和pET-30a(+)载体用NdeI和XhoI内切酶分别在37℃水浴锅中酶切后胶回收，两者在连接酶的作用下常温连接过夜。连接产物转入DH5α细胞，37℃孵育过夜。次日挑取单克隆，摇菌过夜后通过菌液PCR鉴定，片段大小正确的克隆提取质粒DNA ......