正交实验法优选五金散颗粒制备工艺
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摘 要:目的：将五金散原方在汤剂的基础上改制为颗粒剂, 用正交试验法筛选其最佳提取工艺，建立五金散颗粒质量标准。方法：采用L9(34)正交设计安排实验，用TLC进行定性鉴别，用HPLC法进行含量测定。结果：提取最佳工艺为加10倍量水、加热煎煮3次，每次1.5 h；薄层色谱中可检出特征斑点；槲皮素和山奈素的加样回收率分别为98.82% (RSD=1.07%)和99.51%(RSD=1.10%)(n=5)。结论：经正交设计优化的五金散颗粒的制备工艺可行；HPLC法易于操作，重复性好，能够控制五金散颗粒的质量。
关键词：五金散颗粒；制备工艺；正交试验；HPLC
中图分类号：R283.3文献标识码：B文章编号：1673-2197(2007)07-049-03
五金散以金钱草、虎杖、大黄、海金沙、鸡内金等几味中药配伍组成中药方剂，是名老中医几十年临床总结的经验方,具有清热利湿、疏肝利胆、活血化瘀排石的作用，用于湿热型胆囊炎、胆囊结石及泌尿系统结石等，临床运用屡见成效。原方为汤剂，服用量大，不易携带。为此，对其进行剂型改造并确保原有疗效，兼顾各种剂型一次服用量的限度,将原方改为颗粒剂。通过正交试验，优选出最佳提取工艺,并建立质量标准。
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1 仪器与试剂
实验药材(广东省中医院中药房)；Agilent I100液相色谱仪包括紫外检测器(美国惠普)，威玛龙色谱数据工作站；CQ-250型超声波清洗器(330kHz，250W)， 槲皮素和山奈素对照品(由中国药品生物制品检定所提供，批号分别为100081-200307和110861-200308)；甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 提取工艺
2.1.1 正交设计 根据预试验结果及处方中各药材的性质，将药材与水共煮。以溶剂用量、提取时间、提取次数作为3个考察因素，因素水平见表1。以浸膏中主要有效成分槲皮素和山奈素的提取率和出膏率为考察指标。
2.1.2 实验安排及结果 称取处方规定量的药材饮片共9份，采用L9(34)正交表安排实验，测定出膏率及山奈素转移率，以综合评分的方式对实验结果进行分析，结果见表2，方差分析见表3。从表2、表3结果分析可以看出,9次正交试验结果表明，提取次数对浸膏收率及山奈素含量均有显著影响，各因素的影响程度依次为提取次数>提取时间>溶剂用量，综合分析各个因素对山奈素转移率和出膏率的影响，最后选定最佳提取条件为10倍量水，煎煮提取3次、每次1.5h。按此优化条件做三次验证实验，结果如表4所示。从表4结果可知，所选工艺条件均优于L9(34)正交表中任一工艺条件。
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2.2 辅料选用
颗粒剂常用辅料有糖份、糊精、淀粉等。为使产品口感好，含糖量又不高，选用糊精、淀粉(1∶2)加适量甜菊苷作辅料，制成混悬性颗粒剂。
2.3 制备工艺
取处方规定量的药材，以水为浸出溶媒，用煎煮法分三次提取，共4.5 h，合并三次煎煮液，浓缩至一定相对密度，加入95%乙醇至含醇量达60%，搅匀，静置24小时，取上清液，回收乙醇至无醇味，得相对密度为1.15～1.20的清膏，将清膏浓缩成浸膏，加糊精、淀粉及适量甜菊苷，制粒，烘干，整粒，分装，即得成品。
3 定性鉴别
金钱草的薄层鉴别：取本品1g，加甲醇30 ml置水浴上回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水15ml使溶解，用醋酸乙酯振摇提取2次。每次l5 ml，弃去醋酸乙酯液，水层再用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次25 ml，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液。另取金钱草对照药材粗粉4g。同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5:3:0.5:1)为展开剂，展至9cm，取出晾干，再以相同展开剂，同一方向展开至相同距离，取出晾干，喷以三氧化铝试液，70℃加热5分钟，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上.显相同颜色的斑点。
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4 含量测定
4.1 色谱条件
色谱柱为Diamonsil C18柱(4.6mm ×250mm，5μm)，流动相为甲醇-0.4%磷酸(55：50)，流速1.0ml/min，检测波长360nm，柱温：35℃，进样量：5μL；理论板数按槲皮素计算不低于5000。在此条件下，样品中槲皮素和山奈素色谱峰分别与其它成分分离良好。
4.2 对照品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的槲皮素和山奈素对照品5.12mg、5.02mg，置10ml量瓶中，加80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液(槲皮素0.512mg/m1、山奈素0.502mg/m1)，精密吸取lml，置10ml量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液(槲皮索51.2μg/ml、山奈素50.2μg/m1)。
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4.3 供试品溶液的制备
取五金散颗粒约3g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足流失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液25ml，精密加入盐酸5ml，置90℃水浴巾加热水解lh，取出，迅速冷却，转移至50 ml量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm 的微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液[1]。
4.4 线性关系考察
分别精密吸取槲皮素对照品溶液1、2、3、4、5 μL和山奈素对照品溶液1、2、3、4、5 μL，按上述色谱条件测定峰面积。以色谱峰峰面积为纵坐标，对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，计算回归方程，槲皮素：Y=1.920×106X +1.713×104，γ=0.9998，线性范围0.1255～2.259μg；山奈素：Y=2.200×106X+7.130×104，γ=0.9994，线性范围0.124～2.267μg。
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4.5 精密度试验
分别精密吸取同一份对照品溶液5μL，连续进样5次，测得槲皮素色谱峰峰面积平均值为889230，RSD为0.78 %。山奈素峰面积平均值为459364，RSD为1.95 %，说明仪器精密度良好。
4.6 稳定性试验
精密吸取同一样品溶液5μL，分别在制备后0、2、4、6、8、12、24 h进样，测定槲皮素和山奈酚色谱峰峰面积，计算峰面积RSD分别为1.53 %和1.72 %，说明样品溶液24 h内稳定性良好。
4.7 重现性试验
取批号1同一样品，精密称取5份，按样品测定方法，分别测定槲皮素和山奈素含量。结果槲皮素和山奈素的平均含量分别为0.2576 mg.mL-1、0.0255 mg.mL-1 ，RSD分别为1.02 % 、1.53 % 。
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4.8 回收率试验
取已知含量的同一批供试品5份，1.0g/份，精密称定，分别加入槲皮素和山奈索对照品适量，按4.3项下方法制备测定，计算回收率。结果槲皮索平均回收率为98.82%，RSD=1.07% (n=5)，山奈素平均回收率为99.51% ，RSD=1.10% (n=5)。
4.9 样品含量测定
取样品3批，按样品溶液的制备方法分别制备样品溶液，依法测定
5 讨论
(1)本文采用水煮醇沉等综合性制备工艺，能去除药材中大量水溶性及醇溶性杂质，尽可能地提取出了有效成分。改剂后的颗粒剂，有效成分含量较高，稳定性良好，服用方便，易于保存。
(2)本实验样品溶液的制备是参照《中国药典》2005年版I部金钱草含量测定项下供试品溶液制备的方法[2]，因本样品为颗粒剂，因此把回流1 h改为超声30min，经试验证明该法提取效果较好，干扰成分较少。
(3)五金散颗粒剂中金钱草为君药，其主要化学成份为黄酮类，采用HPLC法测定五金散颗粒中槲皮素和山奈素的含量，分离度好，回收率高，能有效控制金钱草的含量。
参考文献：
[1] 杨小苹，于佳华.金钱草品种来源及临床功用辨析[J].中国药师，2000，11(8)：717.
[2] 国家药典编委会.中华人民共和国药典一部[S].北京：化学工业出版社，2005.152., 百拇医药(刘晓兰)