紫草多糖对S180荷瘤小鼠红细胞膜流动性与带3蛋白的影响
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摘 要:目的：观察紫草多糖对S180荷瘤小鼠瘤重、红细胞膜流动性和带3蛋白含量的影响。方法：采用荧光探针DPH标记法测定红细胞膜的荧光偏振度P，计算微黏度(η)与膜脂流动性(LFU)；电泳法测定红细胞膜带3蛋白含量。结果：紫草多糖中剂量组抑瘤率达43.05%；且各剂量组对红细胞膜膜脂流动性、带3蛋白均有影响，以中剂量组效果最佳,与对照组相比P<0.01,P<0.05。结论：紫草多糖通过影响荷瘤小鼠红细胞膜流动性和带3蛋白恢复红细胞的正常功能发挥其抗肿瘤作用。
关键词：紫草多糖；抑瘤率；红细胞膜膜脂流动性；红细胞膜带3蛋白
中图分类号：R969.1文献标识码：A文章编号：1673-2197(2007)09-030-04
自20世纪起，免疫学理论与技术开始用于肿瘤研究，对肿瘤细胞及其代谢产物有了一些重要发现。作为机体免疫系统，白细胞的免疫功能早已为人们所熟悉，而红细胞则一直被认为只是携带氧气和调节血液pH作用[1]。而现已公认，红细胞免疫在机体抗肿瘤中起着重要作用。
紫草粗多糖是紫草水溶性提取物，多糖含量在30%左右。董建英[2]从紫草根水煎剂中提取有效成分——紫草多糖对机体具有增强特异性和非特异性免疫的作用。紫草多糖还具有非特异性的抗炎作用，提高单核巨噬细胞吞噬功能的作用，提高血小板聚集的趋向，降低全血粘度的作用[3]。但是，紫草多糖的抗肿瘤作用却没有报道。我们在体内实验中发现紫草粗多糖对S180荷瘤小鼠有很好的抗肿瘤效果，抑瘤率高达43.05%，于是从红细胞免疫的角度出发，研究红细胞膜流动性和带3蛋白含量的变化，为紫草多糖体内抗肿瘤的研究机制提供理论基础。
1 实验材料
1.1 实验动物及瘤株
昆明种小鼠18~22g(雌雄各半)，S180(肉瘤)均购于哈尔滨医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所。
1.2 实验药品
紫草多糖(ZCP)：徐州弘康科技有限公司，生理盐水溶解,置冰箱备用。
1.3 主要实验仪器
低温高速离心机(BECKMAN AvantiTM68 centrifuge)；电热恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；荧光分光光度计(RF-540，日本岛津公司生产)；电泳仪(美国，Bio-Rad)；凝胶成像系统(美国，Bio-Rad Gel Doc1000)；752紫外-可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)。
1.4 主要试剂
黄芪多糖(APS)：由哈尔滨商业大学博士后工作站提供；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；DPH(Sigma公司生产)；丙烯酰胺；甲叉丙烯酰胺；十二烷基硫酸钠；四甲基乙二胺；过硫酸铵等。
2 实验方法
2.1 小鼠模型、给药及抑瘤率的测定
选用昆明种小鼠，体重(18~22g)，雌雄各半。将小鼠随机分为6组，每组8只。无菌条件下抽取接种第7天的S180荷瘤小鼠腹水(癌细胞数>95%),用无菌生理盐水1∶4稀释,按0.2ml/只(4×107个细胞/ml),小鼠右前肢腋部皮下接种，接种24小时后，分别对6组小鼠进行腹腔给药。分别为ZCP高(400mg/kg)、中(200mg/kg)、低(100mg/kg)剂量组，黄芪多糖(100mg/kg)组,阴性对照组给相同体积的生理盐水，0.2ml/20g,1次/d,连续给药7d，停药24小时后处死，分别称取小鼠体重瘤块重,计算抑瘤率进行三次重复实验。
2.2 小鼠红细胞膜的制备
取上述处死前小鼠新鲜血液3000r/min离心5min，弃上清液，加PBS缓冲液3000r/min离心5min，洗涤3次，再以1∶1比例悬浮于PBS制成红细胞悬液，血球计数板计数。
红细胞悬液加入低渗Tris-HCI溶液，同时加入蛋白酶抑制剂对甲苯磺酰氟(PMSF)，4℃溶血12h，将所得红细胞溶血液以12000r/min，4℃离心15min，弃上清液，低渗Tris-HCI溶液洗涤3次，同上离心，吸取白色沉淀物，最后1∶1悬浮在pH7.4 PBS缓冲液中。
2.3 膜蛋白定量-考马斯亮蓝试剂盒进行测定
根据原始蛋白浓度值，将样品最终稀释至1mg/mL，-20℃保存备用。
2.4 小鼠红细胞膜流动性的测定[4]
(1)细胞膜的荧光标记：取一定量新配制的2mmol/L DPH(Sigma公司生产)四氢呋喃液分别加入到0.5ml RBC膜缓冲液中，25℃温浴30min，用PBS液洗涤1次，最后将细胞悬浮于PBS液中，即得DPH标记的细胞膜。
(2)荧光偏振度的测定：本实验采用日本岛津公司生产的RF-540荧光分光光度计测荧光偏振度。激发波长λex362nm,发射波长λem432nm,狭缝10nm,测温25℃，计算偏振度(P)、微粘度(η)和膜脂流动性(LFU)。
η=2P/0.46-P；LFU=(0.5-P)/P2
2.5 小鼠红细胞膜带3蛋白含量的测定(十二烷基
硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE)
(1)制胶。按表1，根据所需浓度，按比例取各种试剂，混匀，将凝胶溶液平稳地注入两层玻璃中，再在液面上小心注入一层水(2~3cm高)，以隔绝空气，静置直至凝胶的形成。
待分离胶完全聚合(胶层与上面的水相或水饱和异丁醇之间有明显的界面)，吸净上层液体。按比例混匀浓缩胶的各成分，以连续平稳的流速在分离胶上面注入浓缩胶液至玻板顶端，然后小心插入梳子，注意不得在齿尖留有气泡。
待浓缩胶至完全聚合后，取梳子、夹子以及环绕在玻板周围的乳胶条，注意不要改变两块玻板的相对位置。将此凝胶板安置于电泳槽中，在电泳上、下槽即两侧电极槽中注入电泳缓冲液，注意缓冲液与凝胶上下两端之间不要有气泡。气体可用尖端弯曲的滴管排出。
(2)上样。缓冲液按1∶1或1∶2比例与蛋白质样品混匀，100℃保温3~5分钟，冷却至室温。先在凝胶玻璃上做记号，用微量进样器分别吸取膜样品20μl。加样完毕后，立即用电极槽缓冲液进行覆盖，这样在接着加上下槽电极缓冲液时，可以使样品免受干扰。
(3)电泳 ......
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