虎杖中黄酮类成分的提取分离及性质研究
摘 要:α-葡萄糖苷酶抑制剂是一种治疗II型糖尿病的新型口服降糖药。虎杖的茎和根，中医用于活血散瘀，清热利湿等。本实验从中药虎杖中获得了α-葡萄糖苷酶抑制剂:黄酮类物质。探讨了虎杖黄酮的分离提取工艺及其化学、酶学性质。酶学实验表明虎杖黄酮对α-葡萄糖苷酶有较强的抑制作用。通过动物实验，即正常小鼠的餐后血糖实验和虎杖提取物连续给药对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖含量的影响，表明该虎杖提取物有较好的体内降血糖作用。
关键词：虎杖;黄酮;α-葡萄糖苷酶;抑制剂;体内活性
中图分类号：R284.2文献标识码：A文章编号：1673-2197(2007)11-037-06
1 概述
1.1 虎杖
虎杖为蓼科蓼属草本植物。虎杖的根及茎，为我国传统中药，可祛风利湿，散瘀定痛，止咳化痰。迄今已从虎杖中分离得到的化学成分主要有蒽醌及蒽醌甙；芪类化合物；酚性成分；黄酮类化合物。现代药理研究表明虎杖具有降血糖作用，对动物实验性糖尿病，能降低其糖尿病的发生率和死亡率。
, http://www.100md.com
1.2 α-葡萄糖苷酶抑制剂与糖尿病
α-葡萄糖苷酶抑制剂通过抑制存在于小肠粘膜微绒毛膜表面的麦芽糖酶和蔗糖酶等水解酶，能够延缓或减少肠道对碳水化合物消化与吸收，具有降低餐后血糖的作用。α-葡萄糖苷酶抑制剂是一种安全有效的新型口服降糖药。
1.3 本课题的主要研究工作
本课题的研究内容是从原药材虎杖中提取对α-糖苷酶有抑制活性的有效部位——虎杖黄酮，考查其物理、化学性质、酶学性质及温度、pH稳定性质。
2 试剂与仪器
2.1 材料
中药虎杖；D101型大孔吸附树脂。
2.2 试剂
, 百拇医药
2.2.1 α-葡萄糖苷酶酶活力测定试剂配制
磷酸钾缓冲液；α-D-葡萄糖苷酶；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)；还原型谷胱甘肽；Na2CO3终止液；对硝基酚(PNP)。
2.2.2 己糖激酶酶活力测定试剂配制
Tris-HCl缓冲液；葡萄糖；辅酶Ⅱ溶液；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；MgCl2溶液；己糖激酶酶溶液；ATP溶液；还原型辅酶Ⅱ标准液。
2.2.3 提取及成分分析试剂
三氯化铁试剂；茚三酮试剂；双缩脲试剂；香草醛-盐酸试剂；Frhde试剂；α-萘酚试剂；磷钼酸试剂。
2.3 仪器与设备
, http://www.100md.com 电热恒温水浴锅；752紫外光栅分光光度计；低速离心机；热恒温鼓风干燥箱；旋转蒸发器；冻干机；-86℃冰箱；电子分析天平等。
3 实验方法
3.1 虎杖中有效成分的提取分离
3.1.1 虎杖中黄酮类成分的提取
乙醇浸提：200g虎杖，用60%乙醇浸提,过滤，滤液用60%的无水乙醇浸提，过滤，反复共3次，得初提液。减压浓缩，回收乙醇，得到浸膏。
水醇法除叶绿素：乙醇浓缩液加蒸馏水离心,沉淀即为叶绿素，弃去。
石油醚脱脂：浸膏用蒸馏水洗下，石油醚脱脂，回收石油醚。脂类物质无抑制剂活性，水相有强的抑制剂活性。
乙醇洗脱：用40%乙醇洗脱至无色，再用70%乙醇洗脱至无色，最后用无水乙醇洗脱至流出液呈无色。
, 百拇医药
3.1.2 大孔吸附树脂处理
预处理:取200mlD101大孔吸附树脂，用无水乙醇浸泡1天。
装柱：采取湿法装柱，加入无水乙醇连续冲洗至洗出液与蒸馏水1∶2混合后不产生混浊为止，改用大量蒸馏水冲洗至无醇味，用pH=9的NaOH溶液洗柱。
洗脱：样品溶于少量蒸馏水，加至柱上端。先用水洗脱，至洗出液无色；再分别用40%乙醇、70%乙醇溶液洗脱，最后用无水乙醇溶液洗脱。40%、70%和100%乙醇洗脱液分别减压浓缩。
3.2 提取物成分分析
3.2.1 检测氨基酸
样品中滴加数滴茚三酮溶液，加热至沸腾，冷却后如显蓝紫色表明含氨基酸。
, 百拇医药
3.2.2 检测蛋白质
样品中加入适量双缩脲试剂，冷却后如果显紫红色表明可能含蛋白质或肽类。
3.2.3 检测酚类
样品中加入三氯化铁试剂，如显蓝绿色表明可能含有酚类。将样品点样于滤纸上，喷洒香草醛-盐酸试剂，具有间苯三酚或间苯二酚结构的物质显红色。
3.2.4 检测糖类
样品中加入α-萘酚试剂，再滴加少量浓硫酸。如果样品液于浓硫酸接触面产生紫红色环，即表明可能存在糖类、甙类或其它还原性物质。
3.2.5 检测皂甙
样品的乙醇提取液蒸去乙醇后的残渣溶解或悬浮于醋酐中，滴加1滴浓硫酸，如果显示紫红色并且溶液上层逐渐变绿，表明含甾体三萜类或皂甙。
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样品中加入Frhde试剂数滴，当皂甙遇此试剂时初呈橘红色，渐变紫黑色。
3.2.6 检测黄酮类
取乙醇提取液，加入镁粉，再加入浓盐酸，如果产生的泡沫处显桃红色则可能含有黄酮类物质。
三氯化铝反应：将样品溶于甲醇中，加三氯化铝甲醇溶液，3-羟基黄酮、5-羟基黄酮与Al3+产生螯合物而呈鲜黄色。
3.2.7 检测生物碱类
取提取液，加入磷钼酸溶液，若出现白色或黄褐色无定形沉淀，再加氨水沉淀转变为蓝色，则可能含有生物碱类。
3.2.8 检测蒽醌类
样品溶于无水乙醇，点样于滤纸上，喷KOH溶液，在紫外下显黄、橙、紫色荧光，则表明含有蒽醌类物质。
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3.2.9 检测鞣质
取明胶于试管，加入样品水溶液，若产生沉淀，则表明含有鞣质。
3.2.10 发泡性实验
取提取物，加水煮沸后滤出水液，振摇产生持久性泡沫，则皂甙检验为阳性。
3.3 有效成分的酶学性质
3.3.1 抑制剂的溶解性
在抑制剂粉末中分别加入蒸馏水、95%乙醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、环己烷溶液，观察其溶解情况。
3.3.2 有效成分对pH的稳定性试验
先将虎杖提取物用pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的缓冲液配成浓度为0.5mg/ml的溶液，取不同pH的提取物溶液测定其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，取不同pH的提取物溶液测定其对己糖激酶的激活活性。
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3.3.3 抑制剂对温度的稳定性试验
先将的抑制剂溶液分别于20、40、60、80、100℃保温,迅速冷却至室温，然后各取20μl测定对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。
3.3.4 虎杖提取物与α-葡萄糖苷酶和己糖激酶作用时间对酶活的影响
在试管中依次加入磷酸钾缓冲液、还原型谷胱甘肽、α-葡萄糖苷酶和虎杖提取物溶液，37℃分别保温0.5、1、2、4、6min,加PNPG反应后测定抑制活性。
在Tris-HCl缓冲液溶液中，依次加入葡萄糖溶液，辅酶Ⅱ，G-6-PDH，氯化镁溶液，己糖激酶和虎杖提取液,在37℃下保温0.5、1、2、4、10min，加ATP溶液为反应开始，在340nm处扫描6min内吸光度的变化。
3.3.5 虎杖提取物不同加量对酶活性的影响
在各试管中加入磷酸缓冲液，还原型谷光甘肽，α-葡萄糖苷酶，然后分别加入0、5、10、15、20、25、30、35、40μl浓度为0.25mg/ml的虎杖提取物溶液，再用磷酸缓冲液补充测酶活体系为1ml,测定对α-葡萄糖苷酶抑制活性。
在各试管中依次加入Tris-HCl缓冲液溶液，葡萄糖溶液，辅酶Ⅱ，G-6-PDH，10μl氯化镁溶液，己糖激酶,然后分别加入0、20、40、60、80、100、200μl桑叶提取物溶液,再用Tris-HCl缓冲液补充体系总体积为0.99ml，在37℃下保温，加ATP溶液为反应开始，在340nm处扫描6min内吸光度的变化。, http://www.100md.com(周 媛 沈忠明)
关键词：虎杖;黄酮;α-葡萄糖苷酶;抑制剂;体内活性
中图分类号：R284.2文献标识码：A文章编号：1673-2197(2007)11-037-06
1 概述
1.1 虎杖
虎杖为蓼科蓼属草本植物。虎杖的根及茎，为我国传统中药，可祛风利湿，散瘀定痛，止咳化痰。迄今已从虎杖中分离得到的化学成分主要有蒽醌及蒽醌甙；芪类化合物；酚性成分；黄酮类化合物。现代药理研究表明虎杖具有降血糖作用，对动物实验性糖尿病，能降低其糖尿病的发生率和死亡率。
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1.2 α-葡萄糖苷酶抑制剂与糖尿病
α-葡萄糖苷酶抑制剂通过抑制存在于小肠粘膜微绒毛膜表面的麦芽糖酶和蔗糖酶等水解酶，能够延缓或减少肠道对碳水化合物消化与吸收，具有降低餐后血糖的作用。α-葡萄糖苷酶抑制剂是一种安全有效的新型口服降糖药。
1.3 本课题的主要研究工作
本课题的研究内容是从原药材虎杖中提取对α-糖苷酶有抑制活性的有效部位——虎杖黄酮，考查其物理、化学性质、酶学性质及温度、pH稳定性质。
2 试剂与仪器
2.1 材料
中药虎杖；D101型大孔吸附树脂。
2.2 试剂
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2.2.1 α-葡萄糖苷酶酶活力测定试剂配制
磷酸钾缓冲液；α-D-葡萄糖苷酶；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)；还原型谷胱甘肽；Na2CO3终止液；对硝基酚(PNP)。
2.2.2 己糖激酶酶活力测定试剂配制
Tris-HCl缓冲液；葡萄糖；辅酶Ⅱ溶液；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；MgCl2溶液；己糖激酶酶溶液；ATP溶液；还原型辅酶Ⅱ标准液。
2.2.3 提取及成分分析试剂
三氯化铁试剂；茚三酮试剂；双缩脲试剂；香草醛-盐酸试剂；Frhde试剂；α-萘酚试剂；磷钼酸试剂。
2.3 仪器与设备
, http://www.100md.com 电热恒温水浴锅；752紫外光栅分光光度计；低速离心机；热恒温鼓风干燥箱；旋转蒸发器；冻干机；-86℃冰箱；电子分析天平等。
3 实验方法
3.1 虎杖中有效成分的提取分离
3.1.1 虎杖中黄酮类成分的提取
乙醇浸提：200g虎杖，用60%乙醇浸提,过滤，滤液用60%的无水乙醇浸提，过滤，反复共3次，得初提液。减压浓缩，回收乙醇，得到浸膏。
水醇法除叶绿素：乙醇浓缩液加蒸馏水离心,沉淀即为叶绿素，弃去。
石油醚脱脂：浸膏用蒸馏水洗下，石油醚脱脂，回收石油醚。脂类物质无抑制剂活性，水相有强的抑制剂活性。
乙醇洗脱：用40%乙醇洗脱至无色，再用70%乙醇洗脱至无色，最后用无水乙醇洗脱至流出液呈无色。
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3.1.2 大孔吸附树脂处理
预处理:取200mlD101大孔吸附树脂，用无水乙醇浸泡1天。
装柱：采取湿法装柱，加入无水乙醇连续冲洗至洗出液与蒸馏水1∶2混合后不产生混浊为止，改用大量蒸馏水冲洗至无醇味，用pH=9的NaOH溶液洗柱。
洗脱：样品溶于少量蒸馏水，加至柱上端。先用水洗脱，至洗出液无色；再分别用40%乙醇、70%乙醇溶液洗脱，最后用无水乙醇溶液洗脱。40%、70%和100%乙醇洗脱液分别减压浓缩。
3.2 提取物成分分析
3.2.1 检测氨基酸
样品中滴加数滴茚三酮溶液，加热至沸腾，冷却后如显蓝紫色表明含氨基酸。
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3.2.2 检测蛋白质
样品中加入适量双缩脲试剂，冷却后如果显紫红色表明可能含蛋白质或肽类。
3.2.3 检测酚类
样品中加入三氯化铁试剂，如显蓝绿色表明可能含有酚类。将样品点样于滤纸上，喷洒香草醛-盐酸试剂，具有间苯三酚或间苯二酚结构的物质显红色。
3.2.4 检测糖类
样品中加入α-萘酚试剂，再滴加少量浓硫酸。如果样品液于浓硫酸接触面产生紫红色环，即表明可能存在糖类、甙类或其它还原性物质。
3.2.5 检测皂甙
样品的乙醇提取液蒸去乙醇后的残渣溶解或悬浮于醋酐中，滴加1滴浓硫酸，如果显示紫红色并且溶液上层逐渐变绿，表明含甾体三萜类或皂甙。
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样品中加入Frhde试剂数滴，当皂甙遇此试剂时初呈橘红色，渐变紫黑色。
3.2.6 检测黄酮类
取乙醇提取液，加入镁粉，再加入浓盐酸，如果产生的泡沫处显桃红色则可能含有黄酮类物质。
三氯化铝反应：将样品溶于甲醇中，加三氯化铝甲醇溶液，3-羟基黄酮、5-羟基黄酮与Al3+产生螯合物而呈鲜黄色。
3.2.7 检测生物碱类
取提取液，加入磷钼酸溶液，若出现白色或黄褐色无定形沉淀，再加氨水沉淀转变为蓝色，则可能含有生物碱类。
3.2.8 检测蒽醌类
样品溶于无水乙醇，点样于滤纸上，喷KOH溶液，在紫外下显黄、橙、紫色荧光，则表明含有蒽醌类物质。
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3.2.9 检测鞣质
取明胶于试管，加入样品水溶液，若产生沉淀，则表明含有鞣质。
3.2.10 发泡性实验
取提取物，加水煮沸后滤出水液，振摇产生持久性泡沫，则皂甙检验为阳性。
3.3 有效成分的酶学性质
3.3.1 抑制剂的溶解性
在抑制剂粉末中分别加入蒸馏水、95%乙醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、环己烷溶液，观察其溶解情况。
3.3.2 有效成分对pH的稳定性试验
先将虎杖提取物用pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的缓冲液配成浓度为0.5mg/ml的溶液，取不同pH的提取物溶液测定其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，取不同pH的提取物溶液测定其对己糖激酶的激活活性。
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3.3.3 抑制剂对温度的稳定性试验
先将的抑制剂溶液分别于20、40、60、80、100℃保温,迅速冷却至室温，然后各取20μl测定对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。
3.3.4 虎杖提取物与α-葡萄糖苷酶和己糖激酶作用时间对酶活的影响
在试管中依次加入磷酸钾缓冲液、还原型谷胱甘肽、α-葡萄糖苷酶和虎杖提取物溶液，37℃分别保温0.5、1、2、4、6min,加PNPG反应后测定抑制活性。
在Tris-HCl缓冲液溶液中，依次加入葡萄糖溶液，辅酶Ⅱ，G-6-PDH，氯化镁溶液，己糖激酶和虎杖提取液,在37℃下保温0.5、1、2、4、10min，加ATP溶液为反应开始，在340nm处扫描6min内吸光度的变化。
3.3.5 虎杖提取物不同加量对酶活性的影响
在各试管中加入磷酸缓冲液，还原型谷光甘肽，α-葡萄糖苷酶，然后分别加入0、5、10、15、20、25、30、35、40μl浓度为0.25mg/ml的虎杖提取物溶液，再用磷酸缓冲液补充测酶活体系为1ml,测定对α-葡萄糖苷酶抑制活性。
在各试管中依次加入Tris-HCl缓冲液溶液，葡萄糖溶液，辅酶Ⅱ，G-6-PDH，10μl氯化镁溶液，己糖激酶,然后分别加入0、20、40、60、80、100、200μl桑叶提取物溶液,再用Tris-HCl缓冲液补充体系总体积为0.99ml，在37℃下保温，加ATP溶液为反应开始，在340nm处扫描6min内吸光度的变化。, http://www.100md.com(周 媛 沈忠明)