消痤宁乳膏的药效学研究
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(上海市普陀区人民医院，上海 200060)
摘 要：痤疮为常见的慢性毛囊皮脂腺炎症性皮肤病，发病率达15%以上。青春期男女，可有不同程度的皮损，其临床表现为黑头、粉刺、丘疹、脓疤、囊肿、结节，并可见瘫痕形成。病情较重者需要治疗，然而迄今尚无理想的治疗药物，寻找治疗痤疮的有效药物，成为皮肤美容方面的热门课题之一。笔者采用高效液相色谱法(HPLC)测定消痤宁乳膏中主要有效成分克林霉素和甲硝哇的含量，并拟定其质量标准草案，进行药效学研究。
关键词：消痤宁乳膏；痤疮；药效
中图分类号：R969文献标识码：A文章编号：1673-2197(2009)01-0019-02
1 材料
1.1 动物
昆明小鼠(KM)，体重18～22g，雌雄各半；新西兰大白兔，体重1.5～2.0kg，均由广西医科大学实验动物中心提供。
1.2 仪器
电子分析天平、普通培养箱、厌养发生袋、厌养发生罐、病理图像分析仪、玻璃涂棒。
1.3 试剂
氧气指示剂、营养肉汤、厌养肉汤、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、消痤宁乳膏、巴豆油、琼脂粉、营养琼脂、浓媒焦油溶液、维胺酷维E乳膏。
2 方法
2.1 消痤宁乳膏的体外抗菌实验
2.1.1 药物的配制 取适量的消痤宁乳膏，精密称量，吐温-80溶解，灭菌的营养肉汤稀释，经无菌的0.22 μm过滤器过滤除菌后，无菌的营养肉汤进行对倍稀释法，配制成浓度为0.003～6.25mg含药培养液。
2.2.2 对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌的抑菌和杀菌实验 将金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌分别从斜面培养基接种到肉汤培养液中，置于普通的培养箱35℃培养16～18h；用麦氏标准比浊管调整菌液浓度为1.5×108gCFU/mL，无菌的生理盐水稀释成1×106CFU/mL备用。分别取上述浓度的金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌0.1mL分别加至1mL，含不同浓度药液的试管中于培养箱35℃培养24h后观察有无浑浊，以不出现浑浊的最低浓度为观察最小抑菌浓度(MIC)，再依次取未浑浊的各管培养物0.1mL分别加入无菌的培养皿中，用玻璃涂棒均匀地涂布，倒置于培养箱35℃培养24h，菌落数小于5个的平板中所含最低药物浓度为最小杀菌浓度(MBC)，共做3次平行实验。
2.2.3 对痤疮丙酸杆菌(P.Acne)作用的研究 用上述方法将药物配成 4.9～625μg/mL含药浓度培养液。将P.Acne在35℃厌氧发生罐中进行厌氧培养48h，用无菌的生理盐水稀释到所需的浓度，取菌液0.1mL加入到体积为1mL的不同浓度的无菌药液的试管中。置厌氧罐中35℃培养48h，用氧气指示剂来指示厌氧罐内的氧气含量(当氧气的浓度大于0.5%时，氧气指示剂由紫色或紫红色变成蓝色)。观察有无浑浊，以不出现浑浊的最低浓度为观察最小抑菌浓度(MIC)，再依次取未见浑浊的试管的培养液0.1mL分别加入到含有6%羊血的厌氧培养基中，用玻璃涂棒将液体均匀地涂布在平皿表面，倒置厌氧罐中，在35℃进行培养48h，平板上菌落数小于5个的平板中所含最小药物浓度为最小杀菌浓度(MBC)。
2.1.4 对照管 配成含1%吐温-80的培养液、含菌液的吐温-80培养液，含基质的培养液、含菌液的基质培养液，含药的培养液以及含菌液的培养液对照管，观察各对照管是否有细菌生长。
2.2 对巴豆油致小鼠耳廓炎症的影响
将昆明小鼠40只，雌雄各半，体重为18～22g，随机分为4组，每组10只，分别为：基质组、维胺酷维E乳膏(1次/d)、消痤宁乳膏高剂量组(2次/d)、消痤宁乳膏低剂量组(1次/d)。将药物涂于小鼠右耳廓，左耳作对照，连续给药7d，末次给药后1h，用温水洗去药膏，将2%巴豆油混合致炎剂(2%巴豆油、20%无水乙醇、5%蒸馏水和73%乙醚)0.05mL涂在各组小鼠右耳廓以引起炎症。致炎4h后将小鼠颈椎脱臼处死，沿耳廓基线剪下左右两耳，6mm打孔器将双耳相同的部位等面积打下圆耳片，用电子天平称重，以右耳片重-左耳片重之差为肿胀度，比较组间差异，来评价药物对巴豆油混合致炎剂所致耳廓炎症的影响，用下面公式并计算用药组肿胀抑制率。
抑制率=基质空白组肿胀度-实验组肿胀度基质空白组肿胀度×100%
2.3 对兔耳实验性痤疮模型的治疗作用
取新西兰白兔30只，第一组6只为正常组，不涂任何药物；余下24只家兔，在左右耳内侧面耳管开口处ZcmXZcm范围，每日涂煤焦油1次，每次0.5mL，连续2周。将24只大白兔随机分为4组，分别为：模型对照组(局部外涂赋形剂，2次/d)，消痤宁乳膏高剂量组(局部外涂消痤宁乳膏，2次/d)、消痤宁乳膏低剂量组(局部外涂消痤宁乳膏，1次/d)，阳性对照组(维胺酷维E乳膏，2次/d)，连续用药2周。每日除给药外，应肉眼观察局部给药处皮肤的变化：耳厚薄、硬度、粗燥程度、毛囊口有无黑角栓等。末次给药后24h，用温水洗去药膏，取下每只兔耳基本相同的部位皮肤(全层)，10%福尔马林溶液固定后，HE染色后，光镜下观察病理组织学改变，并进行显微照相观察组织学变化。
组织学判定标准：“0”为无粉刺；“+”为毛囊漏斗部可见少量致密角化物质；“++”为毛囊漏斗部可见中等量致密角化物质，并向皮脂腺延伸；“+++”为扩张毛囊内有广泛的角化物质，与人类开放性粉刺相似。
2.4 统计方法
实验数据用±s表示，SPSS 13.0统计软件进行数据处理，P<0.05表示有显著性意义，P<0.01表示差异有明显的显著性差异。
3 结果
3.1 消痤宁乳膏体外抗菌作用
(1)对照管细菌生长情况结果见表1。
注：-：无细菌生长；+：有细菌生长
说明吐温-80、培养基液和含药的培养液都没有被细菌污染，细菌分别能在培养液和含吐温-80培养液中正常繁殖。
(2)抗菌作用。
表2 消痤宁乳膏的体外抗菌作用
菌种MIC(mg/mL)MBC(mg/mL)
含黄色葡萄球菌0.0240.048
白色葡萄球菌0.0060.098
痤疮丙酸杆菌0.0200.156
结果表明，消痤宁乳膏对痤疮的主要致病菌金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌均有一定的抑制和杀灭作用。
3.2 消痤宁乳膏对小鼠耳廓炎症的抑制作用
实验结果见表3所示，低剂量组可明显抑制巴豆油诱发小鼠耳片的肿胀；高剂量组对小鼠耳片肿胀抑制率达41.18%；阳性对照组对小鼠耳片肿胀抑制率为23.53%。
表3消痤宁乳膏对小鼠耳廓炎症的抗炎作用
菌种肿胀度(mg)抑制率(%)
基质空白组18.1±2.70
维胺酯维E乳膏14.4±1.2*15.29
消痤宁乳膏低剂量13.0±2.7*23.53
消痤宁乳膏高剂量10 ......
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