大容量人源肝癌核糖体展示单链抗体库的构建
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王溪桥 韩跃武 杨浩 查成喜 兰州大学基础医学院生物化学与分子生物学研究所;
【摘要】目的:构建人源肝癌天然库容量大、多样性好的核糖体展示单链抗体库,为开发治疗性人源抗体奠定良好的实验基础。方法:分别收集40例人新鲜外周血各2mL(包括健康成年人和肝癌患者),进行淋巴细胞分离和总RNA的提取,通过设计合适的优化引物用RT-PCR技术扩增人抗体重链可变区基因(variable region of heavy chain,VH)、轻链可变区基因(variable region of light chain,VL)和作为间隔区的轻链恒定区基因(consis tregion of light chain,CK)。采用改进的重叠延伸PCR(SOEPCR)技术将VH和VL进行拼接,连接肽为Linker(Gly4Ser)3。之后引入构建核糖体展示单链抗体(scFv)库模板所需元件,包括一个T7启动子、一个核糖体结合位点(Kozak序列)和翻译起始密码,以及作为间隔区的CK基因。模板基因片段连接T-载体转化E.coliDH5a大肠杆菌,对所构建的单链抗体库进行菌落PCR鉴定和测序分析。结果:①构建了库容量为2.65×1013的人源肝癌单链抗体库;②经菌落PCR鉴定和测序分析阳性重组子的序列,我们发现该抗体库具有丰富的多样性。结论:采用改进的重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法,对构建库容量高、多样性好的人源性肝癌核糖体展示单链抗体库,提高了建库效率。成功构建的抗体库,为后续筛选抗体、抗体修饰等工作打下扎实的实验基础。
【关键词】 肝癌 核糖体展示技术 重叠延伸PCR 单链抗体库
【分类号】R392;R735.7
目前,肝癌是我国仅次于胃癌、食道癌的第三大常见恶性肿瘤,初期症状并不明显,治疗后其复发率很高,是预后最差的恶性肿瘤之一[1]。因此,我们构建了源于肝癌患者及正常人外周血淋巴细胞重链轻链可变区基因的核糖体展示单链抗体库,并对其做鉴定,为今后进一步筛选肝癌特异性抗原
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目前，肝癌是我国仅次于胃癌、食道癌的第三大常见恶性肿瘤，初期症状并不明显，治疗后其复发率很高，是预后最差的恶性肿瘤之一。因此，我们构建了源于肝癌患者及正常人外周血淋巴细胞重链轻链可变区基因的核糖体展示单链抗体库，并对其做鉴定，为今后进一步筛选肝癌特异性抗原的单链抗体奠定一定的实验基础，对进一步开发诸如免疫毒素、免疫脂质体等抗肿瘤药物，以及对肿瘤的疫苗开发都具有非常显著的现实意义。
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