人G6PDT279A和T279S两种突变子的体外构建
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摘要目的：构建葡萄糖6 磷酸脱氢酶(Glucose 6-phosphate dehydrogenase，G6PD)T279A和T279S两种突变子。方法：以GenbankNo X03674 为参考序列设计并合成引物、以含G6PD 基因的质粒(Philip J Mason 博士惠赠)为模板，PCR 扩增获得G6PD 野生型基因片段，琼脂糖凝胶电泳后回收PCR 产物，连接、转化构建克隆质粒pMD18T-G6PD；酶切pMD18T-G6PD质粒、电泳后回收目的基因片段，连接、转化构建含G6PD 野生型基因的重组质粒pAL-G6PD；设计并合成含有突变序列的引物，以pAL-G6PD 为模板，体外扩增获得G6PD835-海口(835A寅G，T279A)和835- 中国-1(835 A寅T，T279S)突变子。结果：酶切后经电泳鉴定表明获得与预期大小相符的pMD18T-G6PD质粒，EcoR I和Hind III双酶切获得与预期大小相符的pAL-G6PD，测序结果与参考序列完全一致。0.8%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，并定量pAL-G6PD 单链DNA浓度约为200ng/uL。经测序鉴定并与参考序列比对结果表明获得了G6PD 的T279A 和T279S 两种突变子。结论：成功构建了G6PD 的T279A和T279S两种突变子，为下一步原核表达、生化性质以及酶动力学等研究奠定了基础。
关键词：葡萄糖6 磷酸脱氢酶；葡萄糖6 磷酸脱氢酶缺乏症；定点突变；聚合酶链反应
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