Ad-hBNP重组腺病毒的构建
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宋衍秋 赵莉莉 毛用敏 崔让庄 天津医科大学;天津市胸科医院;
【摘要】目的:构建携带人BNPcDNA片段高效重组腺病毒Ad-hBNP,为实验提供研究工具。方法:从人心肌组织提取的RNA,用RT-PCR方法中获得hBNP扩增片段,与pUCm-T载体连接构成pUC-hBNP重组质粒;用KpnI、SalI分别双酶切pUC-hBNP和pAd-Track-CMV,将目的片段插入pAd-Track-CMV构建重组质粒pAdTrack-CMV-hBNP;pAdTrack-CMV-hBNP重组质粒经PmeI酶切线性化后,电转法转入含有腺病毒骨架质粒的E.coliBJ5183感受态细胞中,同源重组获得重组质粒pAdEasy-hBNP;经BamHI、PacI酶切鉴定及基因序列检测后,重组成功的pAdEasy-hBNP经阳离子脂质体法转染HEK293T细胞,经过包装、扩增和纯化后,测定病毒滴度,电镜检测病毒形态。结果:转染HEK293T细胞5-6天GFP呈"彗星"状;重组腺病毒滴度为1.1×1012V.P/ml;电镜检测重组腺病毒为多面体结构。结论:应用Ad-Easy缺陷性腺病毒载体系统成功构建重组腺病毒Ad-hBNP,为进一步基因治疗研究提供分子生物学工具。
【关键词】 脑钠肽 腺病毒载体 同源重组 基因治疗
【基金】天津市卫生局基金项目(项目编号:07KY01)
【分类号】Q78,541.61
基因治疗是目前新兴的生物学治疗方法,它的研究已从单基因遗传病扩展到多个病种范围,随着心血管疾病分子机理水平研究的深入,基因治疗有望开拓心血管疾病防治的新途径。本研究旨在构建携带人BNP cDNA片段含有绿色荧光蛋白的重组腺病毒,为进一步研究提供有效的分子生物学工具,
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摘要 目的：构建携带人BNP cDNA片段高效重组腺病毒Ad-hBNP，为实验提供研究工具。方法：从人心肌组织提取的RNA，用RT-PCR方法中获得hBNP扩增片段，与pUCm-T载体连接构成pUC-hBNP重组质粒；用KpnI、sall分别双酶切puC-hBNP和pAd-Track-CMV，将目的片段插入pAd-Track-CMV构建重组质粒pAdTrack-CMV-hBNP；pAdTraek-CMV-hBNP重组质粒经PmeI酶切线性化后，电转法转入含有腺病毒骨架质粒的E.coli BJ5183感受态细胞中，同源重组获得重组质粒pAdEasy-hBNP；经BamHI、PacI酶切鉴定及基因序列检测后，重组成功的pAdEasy-hBNP经阳离子脂质体法转染HEK293T细胞，经过包装、扩增和纯化后，测定病毒滴度，电镜检测病毒形态。结果：转染HEK293T细胞5-6是GFP呈“彗星”状；重组腺病毒滴度为1.1×1012V.P/ml；电镜检测重组腺病毒为多面体结构。结论：应用Ad-Easy缺陷性腺病毒载体系统成功构建重组腺病毒Ad-hBNP，为进一步基因治疗研究提供分子生物学工具。
关键词：脑钠肽；腺病毒载体；同源重组；基因治疗
中图分类号：Q78，541.61 文献标识码：A 文章编号：1673-6273(2009)05-863-05
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