一种高效经济的小鼠胰岛细胞分离纯化新技术
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梁瑜祯 杨月莲 罗静思 刘丹 冯乐平 广西医科大学第一附属临床医院糖尿病研究中心;桂林医学院生物技术学院;
【摘要】目的:建立一种经济高效的小鼠胰岛细胞分离纯化方法,为进行NOD小鼠的胰岛移植提供实验条件。方法:将5-7周龄、体重20～25g的雄性昆明小鼠的胆总管结扎,并逆行Hank's液和胶原酶P灌注和分离消化,依次加入84%、67%、50%浓度的Histopaque介质后进行不连续密度梯度离心纯化胰岛细胞。双硫腙(dithizon,DTZ)和台盼兰染色分别鉴定胰岛细胞。用含5.6mmol/L葡萄糖DMEM培养液体外培养胰岛细胞,培养后的第3、5、7、9、11天取细胞上清检测胰岛素水平,并用16.7mmol/L的高浓度葡萄糖进行刺激,检测胰岛素水平确定胰岛细胞功能。结果:每个胰腺的胰岛细胞收获量在1200±124个,且纯度和活性均大于90%;体外培养9天内胰岛细胞基础胰岛素分泌水平无显著差异,至第11天时则明显减少(P0.05);应用16.7mmol/L葡萄糖刺激后,第5、7、9、11天的胰岛素分泌水平较第3天的明显减少(P0.05),然而在第7天、9天、11天时的胰岛素水平较第5天时显著降低。结论:胆总管逆行注射Hank's液和胶原酶P消化消化和不连续密度梯度Histopaque纯化的方法可以获得大量状态良好的胰岛,且胰岛细胞数量多,分泌状态良好。本分离方法是一种经济高效的胰岛细胞分离方法,同时离体后于5.6mmol/L葡萄糖DMEM培养第3天胰岛细胞胰岛素储备功能最佳,为移植研究的最佳状态。
【关键词】 胰岛素 分离和纯化 细胞培养
【基金】国家自然科学基金资助课题(30860116) 广西科技厅青年基金资助课题(0339026) 广西科技厅自然科学基金资助课题(0542083)
【分类号】Q813
1型糖尿病是自身反应性T细胞破坏胰岛β细胞引起的自身免疫性疾病,胰岛移植是有效治疗方法之一。2000年Ed-monton实验室采用胰岛移植与免疫抑制联合,极大的提高胰岛细胞移植的成功率,为1型糖尿病患者带来希望。而胰岛细胞分离技术是胰岛移植中至关重要的一步,如何以快速、经
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摘要 目的：建立一种经济高效的小鼠胰岛细胞分离纯化方法，为进行NOD小鼠的胰岛移植提供实验条件。方法：将5.7角龄、体重20～25 g的雄性昆明小鼠的胆总管结扎，并逆行Hank's液和胶原酶P灌注和分离消化，依次加入84%、67%、50%浓度的Histopaque介质后进行不连续密度梯度离心纯化胰岛细胞。双硫腙(dimizon，DTZ)和台盼兰染色分别鉴定胰岛细胞。用含5.6mmol/L葡萄糖DMEM培养液体外培养胰岛细胞，培养后的第3、5、7、9、11天取细胞上清检测胰岛素水平，并用16.7mmol/L的高浓度葡萄糖进行刺激，检测胰岛素水平确定胰岛细胞功能。结果：每个胰腺的胰岛细胞收获量在1200±124个，且纯度和活性均大于90%；体外培养9天内胰岛细胞基础胰岛素分泌水平无显著差异，至第11天时则明显减少(P<0.05)：应用16.7mmol/L葡萄糖刺激后，第5、7、9、11天的胰岛素分泌水平较第3天的明显减少(P<0.05)，然而在第7天、9天、11天时的胰岛素水平较第5天时显著降低。结论：胆总管逆行注射Hank's液和胶原酶P消化消化和不连续密度梯度Histopaque纯化的方法可以获得大量状态良好的胰岛，且胰岛细胞数量多，分泌状态良好。本分离方法是一种经济高效的胰岛细胞分离方法，同时离体后于5.6mm01/L葡萄糖DMEM培养第3天胰岛细胞胰岛素储备功能最佳，为移植研究的最佳状态。
关键词：胰岛素；分离和纯化；细胞培养
中图分类号：Q95-3，R322.57，R587.1 文献标识码：A 文章编号：1673-6273(2009)10-1809-03
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