人脆性组氨酸三联体(FHIT)基因的克隆及在HeLa细胞中表达的研究
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刘慧 梁浩 刘明秋 扈廷茂 内蒙古大学生命科学学院;内蒙古大学哺乳动物生殖生物学及生物技术教育部重点实验室;
【摘要】目的:构建人脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad gene,fhit)基因与报告基因egfp的双顺反子表达载体及融合表达载体,研究fhit基因过表达对HeLa细胞生长及凋亡的影响。方法:根据已知fhit基因的mRNA序列,RT-PCR得到493bp的cDNA序列,将其构建到pMD18-T中,筛选目的片段插入正确的重组质粒,经限制性内切酶切割,回收目的片段分别插入双顺反子表达载体pIRES2-EGFP和融合表达载体pEGFP-C1的多克隆位点中。再以脂质体介导转染HeLa细胞,G418筛选稳定转染的克隆,分别通过基因组PCR、RT-PCR、免疫细胞化学及TUNEL法在DNA、RNA和蛋白质水平检测其表达情况。结果:转基因细胞基因组PCR获得493bp片段,证明目的基因已整合到细胞基因组中;RT-PCR检测其在RNA水平得到表达;免疫细胞化学及TUNEL法分析表明fhit基因在HeLa细胞内实现了稳定遗传与表达。结论:实验证明fhit基因过表达可有效促进HeLa细胞的凋亡。
【关键词】 FHIT 过表达 HeLa细胞 凋亡
【基金】内蒙古自然科学基金项目(重点:200607010502;200711020517)
【分类号】R73-36
前言fhit基因是Ohta[1]等于1996年发现并克隆的一个新的候选抑癌基因,属于组氨酸三联体(hit)基因超家族,定位于人类染色体3p14.2[2],覆盖FRA3B脆性位点、肾细胞癌相关性断裂点t(3;8)、抑癌基因PTPRG(protein-lyrosine phorphalaseγgene)的5'末端及HPVl6整合位点。大量研究表
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摘要 目的：构建人脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad gene，fhit)基因与报告基因egfp的双顺反子表达载体及融合表达载体，研究fhit基因过表达对HeLa细胞生长及凋亡的影响。方法：根据已知fhit基因的mRNA序列，RT-PCR得到493bp的cDNA序列，将其构建到pMD18-T中，筛选目的片段插入正确的重组质粒，经限制性内切酶切割，回收目的片段分别插入双顺反子表达载体pIRES2-EGFP和融合表达载体pEGFP-C1的多克隆位点中。再以脂质体介导转染HeLa细胞，G418筛选稳定转染的克隆，分别通过基因组PCR、RT-PCR、免疫细胞化学及TUNEL法在DNA、RNA和蛋白质水平检测其表达情况。结果：转基因细胞基因组PCR获得493bp片段，证明目的基因已整合到细胞基因组中；RT-PCR检测其在RNA水平得到表达；免疫细胞化学及TUN-EL法分析表明fhit基因在HeLa细胞内实现了稳定遗传与表达。结论：实验证明fhit基因过表达可有效促进HeLa细胞的凋亡。
关键词：FHIT、过表达、HeLa细胞、凋亡
中图分类号：Q31，Q75，R730.231 文献标识码：A 文章编号：1673—6273(2009)15—2808—06
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