基于重叠延伸PCR法的定点突变技术
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戴灿 苗聪秀 卢光琇 中南大学生殖与干细胞工程研究所 人类干细胞国家工程研究中心;
【摘要】目的:建立一种高效而经济的定点突变方法。方法:采用重叠延伸PCR定点突变技术,引物设计时引入目的突变,以前两次PCR产物为模板,进行第三次PCR,即可获得突变后的目的DNA片段。将此片段连入pMDTM18-T载体后测序验证突变结果。结果:DNA测序表明,待突变位点已由ATTGG突变为ATTTT。结论:成功实现了目的位点的定点突变,重叠延伸PCR法是一种高效且经济的定点突变方法。
【关键词】 重叠延伸PCR 定点突变
【基金】国家高技术研究发展计划(863项目)(2006AA02A102) 国家重点基础研究发展计划(973项目)(2007CB948103)
【分类号】Q75
前言定点突变(Site-directed mutagenesis,SDM)是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法在目的DNA片段的特定位点中引入碱基改变,如插入、缺失、点突变等。定点突变能迅速、高效地提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征,是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具;它还能改造
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前言
定点突变(sire-directed mutagenesis，SDM)是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法在目的DNA片段的特定位点中引入碱基改变，如插入、缺失、点突变等。定点突变能迅速、高效地提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具；它还能改造启动子或DNA作用元件，是基因研究工作中一种非常有用的手段。如何在体外准确而高效地改变目的位点成为研究者最为关心的问题。本文以插入人类CDCA8基因正常启动子片段的报告基因质粒pGL3-269为模板，采用重叠延伸PCR定点突变技术快速准确地将CDCA8启动子上的一个NFY结合位点突变，并将获得的突变启动子片段克隆到pMDTM 18-T载体上，为该片段的进一步克隆和功能的研究提供了便利。
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