PRKAG2基因新突变体重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞中的表达
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陈长源 郑兴 徐荣良 胡建强 秦永文 第二军医大学附属长海医院心内科;
【摘要】目的:构建携带人全长PRKAG2基因新突变体(PRKAG2 G100S)及增强型绿色荧光蛋白报告基因(EGFP)的重组腺病毒载体,并将其在乳鼠心肌细胞中表达。方法:利用Invitrogen的GatewayTM技术,通过重叠PCR技术将目的基因突变体PRKAG2G100S-IRES-EGFP及野生型PRKAG2-IRES-EGFP定向克隆至入门载体pDONR221上,然后与腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST重组反应,形成包含目的基因及EGFP的腺病毒表达克隆。经筛选阳性表达克隆并测序验证后,PacI酶切、包装、扩增、纯化获得携带EGFP及PRKAG2基因的重组体腺病毒。病毒PCR鉴定并将其感染原代培养的SD乳鼠心肌细胞,用Westernblot技术检测PRKAG2蛋白的表达。结果:成功构建了携带人PRKAG2 G100S及EGFP基因的重组腺病毒,病毒的滴度为8.4×108pfu/ml。荧光显微镜下可见Ad-PRKAG2 G100S重组体腺病毒感染后的乳鼠心肌细胞表达EGFP而发出绿色荧光,PCR证实重组腺病毒载体构建成功,Western blot证明PRKAG2蛋白在乳鼠心肌细胞中过表达。结论:成功构建了携带EGFP基因的Ad-PRKAG2 G100S重组腺病毒载体并将其在乳鼠心肌细胞中正确表达,为今后突变体PRKAG2基因的功能研究奠定了基础。
【关键词】 PRKAG基因 突变 腺病毒载体 AMPK
【分类号】Q78
PRKAG2基因是PRKAG2心脏综合征的致病基因,编码AMP激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)的γ2调节亚基[1]。PRKAG2基因在心脏的正常发育过程中发挥着非常重要的作用,PRKAG2基因突变可导致出现家族性心室预激及快速性心律失常(Wolf-Parkinson-White综合征)、进展
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摘 要 目的：构建携带人全长PRKAG2基因新突变体(PRKAG2 G100S)及增强型绿色荧光蛋白报告基因(EGFP)的重组腺病毒栽体。并将其在乳鼠心肌细胞中表达。方法：利用Invitrogen的GatewaTM技术，通过重叠PcR技术将目的基因突变体PRKAG2G100s-IREs-EGFP及野生型PRKAG2-IREs-EGFlP定向克隆至入门载体pDONR221上，然后与腺病毒载体pAd/CMV/V5，DEST重组反应，形成包含目的基因及EGFP的腺病毒表达克隆。经筛选阳性表达克隆并测序验证后，PacI酶切、包装、扩增、纯化获得携带EGFP及PRKAG2基因的重组体腺病毒。病毒PCR鉴定并将其感染原代培养的sD乳鼠心肌细胞，用westemblot技术检测PRKAG2蛋白的表达。结果：成功构建了携带人PRKAG2G100s及EGFP基因的重组腺病毒，病毒的滴度为8.4×108pfu/ml。荧光显微镜下可见Ad-PRKAG2G100s重组体腺病毒感染后的乳鼠心肌细胞表达EGFP而发出绿色荧光，PCR证实重组腺病毒栽体构建成功，Westernblot证明PRKAG2蛋白在乳鼠心肌细胞中过表达。结论：成功构建了携带EGFP基因的Ad-PRKAG2 G100s重组腺病毒载体并将其在乳鼠心肌细胞中正确表达，为今后突变体PRKAG2基因的功能研究奠定了基础。
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