HRB2基因对细胞增值影响的研究
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顾卫娟 毕焕京 李建民 南京医科大学基础医学院;
【摘要】目的:研究HRB2基因对细胞增值的影响。方法:设计4对HRB2 RNA寡核苷酸片段,经退火制备的双链DNA oligo,连接经双酶切的线性化PLKO.1-TRC-SP6载体上,转化后经PCR鉴定,阳性克隆测序,质粒抽提,应用Lipofectamine2000将质粒导入293T细胞,包装成慢病毒,再感染靶细胞293T,用嘌呤霉素筛选15天后,收集细胞抽提RNA,实时定量RT-PCR检测HRB2 mRNA水平,评价干扰效果。Western免疫印迹进一步确认有效作用靶点。通过划痕愈合实验和绘制生长曲线研究HRB2基因对细胞增值的影响。结果:载体构建成功。包装成慢病毒感染293T细胞系,发现:2号和4号靶点敲减HRB2基因效率达84%和88%。差别有统计学意义。通过western进一步证实了2号和4号是抑制HRB2的有效作用靶点。划痕愈合实验和绘制生长曲线的结果显示2号和4号靶点细胞株细胞生长受到抑制,并且4号较2号稍明显。结论:成功构建并筛选了携带有人HRB2基因的shRNA慢病毒载体及有效靶点,研究发现HRB2基因对细胞增值产生了影响,这为进一步研究HRB2的生物学功能提供了实验平台。
【关键词】 HRB RNA干扰 慢病毒 细胞增值
【基金】国家自然科学基金项目(30670790)
【分类号】Q343
前言HIV相关结合蛋白2(HIV-1rev binding protein2),简称HRB2,又叫RIP-1、KRR1p,它的蛋白质由381个氨基酸残基组成,其对应基因全长3357bp,有一个长度为1143个氨基酸残基的开放阅读框架[1]。在Hela、293T、HEK TER细胞系中均能检测到内源性HRB2的表达。在HRB2不同物种的同源蛋
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前言
HIV相关结合蛋白2(HIV-1 rev binding protein 2)，简称HRB2，又叫RIP-1、KILRlp，它的蛋白质由381个氨基酸残基组成.其对应基因全长3357bp，有一个长度为1143个氨基酸残基的开放阅读框架。在Hela、293T、HEKTER细胞系中均能检测到内源性HRB2的表达。在HRB2不同物种的同源蛋白中，酵母的HRB2蛋白(KRR1)是被研究得最彻底的，而人源的HRB2蛋白的报道不多。酵母中的Krrlp能与编码核糖体蛋白的13种蛋白发生相互作用，并调控它们的转录水平。另外对90S核糖体前体进行整体分析发现，有8个非核糖体蛋白与Krrlp发生相互作用。研究表明酵母的KRRl参与了核糖体的加工过程，是一个有转录活性的核仁功能蛋白基因。通过对贾第虫“和果蝇”中krrl的有效调控同样证明了Krrl蛋白参与了rRNA加工。
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