靶向Smad4基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选
RNA干扰,Smad基因,基因克隆,鉴定
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张彩平 龙石银 田英 何云武 崔慧辉 王思远 南华大学生物技术系生物化学与分子生物学教研室;南华大学附属第二医院疼痛科;
【摘要】目的:构建编码Smad4 mRNA的shRNA真核表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体。方法:根据GenBank提供的人Smad4基因的mRNA序列构建2个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,并通过基因测序进行鉴定。经鉴定后转染体外培养人成纤维细胞,western-blot检测Smad4蛋白水平抑制表达效果。结果:构建质粒表达载体测序结果显示,插入片段测序结果与合成的shRNA序列一致;靶向Smad4基因shRNA质粒表达载体对所转染的人成纤维细胞中Smad4蛋白水平表达均有抑制作用,其中shRNA1最为明显。结论:成功构建了靶向Smad4基因shRNA质粒表达载体,其中抑制Smad4基因表达效果最为明显的是shRNA1,为进一步研究Smad4基因的RNA干扰奠定了基础。
【关键词】 RNA干扰 Smad基因 基因克隆 鉴定
【基金】国家自然基金青年项目资助课题(30800474) 湖南省教育厅资助课题(09C832);湖南省教育厅资助课题(08B065)
【分类号】Q789
瘢痕形成是机体创伤修复的必然产物,目前临床上控制和治疗病理性瘢痕的手段、方法较多,但总的说来不理想且术后复发率较高,病理性瘢痕的预防及治疗仍十分棘手。应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术成为近年探讨病理性瘢痕形成机制及治疗的研究热点。TGF-β通过Smads介导
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瘢痕形成是机体创伤修复的必然产物，目前临床上控制和治疗病理性瘢痕的手段、方法较多，但总的说来不理想且术后复发率较高，病理性瘢痕的预防及治疗仍十分棘手。应用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术成为近年探讨病理性瘢痕形成机制及治疗的研究热点。TGF-β通过Smads介导的信号通路刺激ECM蛋白合成与沉积，通过抑制胶原酶的产生，增加胶原酶抑制剂含金属蛋白酶(TIMPⅡ、Ⅱ)、a 2巨球蛋白的组织抑制剂的产生在病理性瘢痕形成中发挥着重要的作用。因此该本研究选取下游信号分子Smad4为靶点，设计并构建针对人smad4基因的小发夹RNA(shRNA)表达载体，为后期研究Smad4基因在纤维化疾病、肿瘤发生中的作用机制和基因治疗的可行性奠定基础。
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