一种基于三顺反子表达载体的生物素诱导表达系统的建立
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叶玲玲 李世崇 刘红 刘兴茂 何文俊 陈昭烈 军事医学科学院生物工程研究所;
【摘要】目的:建立一种以无毒的生物素为诱导剂的哺乳动物细胞诱导表达系统。方法:通过基因组PCR或重叠延伸PCR获得该系统的三个基本构件:大肠杆菌生物素连接酶(BirA)、链亲和素-四环素依赖的抑制因子融合蛋白(SA-TetR)和生物素化信号-VP16转录激活结构域融合蛋白(Avitag-VP16)。将上述基因连入三顺反子表达载体,与响应载体一起共转染293f细胞,以EGFP为报告基因,检测EGFP荧光强度随培养体系中生物素浓度变化的情况。结果:随着生物素浓度的增加,目的基因表达出现OFF-ON-OFF的变化,诱导状态下的EGFP荧光强度约为抑制状态下的3倍。结论:可通过调节生物素浓度对目的基因的表达进行可逆的调节,该系统是一种有应用前景的诱导表达系统。
【关键词】 生物素 三顺反子 哺乳动物细胞 诱导表达系统 EGFP
【基金】国家“重大新药创制”科技重大专项(No.2009ZX09503-011)
【分类号】Q813
前言通过诱导表达来实现目的基因表达的定量调控现已广泛应用于基础和应用研究中,包括,功能基因组研究、组织工程、系统生物学、药物研发、基因治疗、生物药物生产和功能材料的设计等[1-4]。为实现与宿主细胞代谢具有最大的相容性,第一代哺乳动物细胞兼容的调控系统使用具有
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通过诱导表达来实现目的基因表达的定量调控现已广泛应用于基础和应用研究中，包括，功能基因组研究、组织工程、系统生物学、药物研发、基因治疗、生物药物生产和功能材料的设计等。为实现与宿主细胞代谢具有最大的相容性，第一代哺乳动物细胞兼容的调控系统使用具有药物活性的诱导剂分子。如抗生素、免疫抑制药物或激素及其衍生物。尽管这些条件表达系统于初创阶段在培养体系和转基因动物中表现出了良好的调控效果，但临床副作用和抗生素抗性病原体的出现使得它们在基因治疗和生物药物生产中的应用受到了限制。新一代的转基因控制系统使用临床上惰性的诱导剂分子，如精氨酸或维生素H(亦称生物素)。其中，生物素因其绝对无毒、价格低廉，并且是FDA批准的用于生物药物生产的生产培养基的组分，是一种可用于哺乳动物细胞条件转基因控制的理想的诱导分子。
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