毕薇薇，黄若洋，刘洋

    近年来，对间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)的研究越来越细致和深入，MSC 的动物及临床试验研究也越来越广泛。MSC 可来源于骨髓、脐带、脂肪、肌肉等组织，其中研究与应用较多的是自体骨髓 MSC。但由于骨髓来源的 MSC受年龄及身体状况等因素影响，其细胞质量和数量受到很大限制[1]。为此，本实验尝试在体外从人胎儿肝脏中提取 MSC 并研究其生物学特性，以期为将来 MSC 的临床应用奠定基础。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 标本来源 人胎儿肝脏组织来源于四平市中心医院药物流产胎儿，胎龄 2～3 个月，母亲身体健康(捐献者均签署知情同意书)。肝功能正常，肝炎病毒标志物均为阴性。梅毒阴性，HIV 阴性。

    1.1.2 主要试剂与仪器 α-MEM 培养液和优等胎牛血清(FBS)购自美国 Hyclone 公司；胰蛋白酶购自美国 Gibco 公司；II 型胶原酶购自美国Sigma 公司；FITC 标记的小鼠抗人 CD34、CD44、CD105、CD13、HLA-ABC、HLA-DR 单抗购自法国 Immuntech 公司；细胞培养瓶购自美国 Corning公司；371 型高温灭菌 CO2培养箱购自美国Thermo 公司；程序降温盒购自美国 NALGENE 公司；CKX41 型倒置相差显微镜为日本 Olympus 公司产品。

    1.2 方法

    1.2.1 人胎儿肝脏 MSC 的分离与培养 无菌取出胎肝，用 PBS 冲洗数次，剪碎后用 0.25%胰酶消化后 4℃过夜。次日取出于 37℃继续消化 5～10min，吸出细胞悬液，在剩余组织中加入 0.1%的II 型胶原酶，37℃中和 10min，消化后组织用200 目筛网过滤，获得的细胞悬液 270×g离心5min，细胞沉淀用 PBS 洗 2 次。将细胞沉淀置于含 10%胎牛血清的 α-MEM 培养液中，吹打制备成终浓度为1×106/ml 的细胞悬液。将细胞悬液加入装有含 10%胎牛血清的 α-MEM 培养液的25cm2培养瓶中，置于 37℃、5%CO2培养箱中培养。48 h 后，吸出悬浮细胞液体，更换新培养液；随后 2～3 d 换液 1 次 ......