刘毅华，童梅，刘金毅，徐晨

    基于SM 蛋白的CHO细胞分泌工程化改造和抗体表达的研究

    刘毅华，童梅，刘金毅，徐晨

    210009 南京，中国药科大学生命科学与技术学院(刘毅华)；102600 北京三元基因工程有限公司(童梅、刘金毅、徐晨)

    通过构建基于 SM 基因的分泌工程化改造的 CHO-AV-SM 细胞株，探讨在悬浮培养条件下，过表达转运蛋白 SM 基因对分泌蛋白表达的影响。

    首先从人 HEK293FT 细胞中克隆出s1 和18c基因，然后构建含有 SM 基因的真核表达载体 pBSM；随后将 pBSM 质粒稳定转染入 CHO-AV 细胞并鉴定，获得了基于 SM 基因的分泌工程化改造的 CHO-AV-SM 细胞株；在此基础上对 CHO-AV-SM 细胞株进行悬浮培养适应，并测定了 CHO-AV 和 CHO-AV-SM 细胞株的生长和蛋白表达参数。

    过表达转运蛋白 SM 基因，CHO-AV-SM 细胞株的抗体表达量较 CHO-AV 抗体表达量提高约 75%，且测得第 6 天细胞数达到最大值，此时 CHO-AV 的表达量约为 45.4 μg/ml，CHO-AV-SM 的表达量为 79.5 μg/ml。

    通过构建全抗稳定表达细胞，在细胞中过表达 SM 基因，并悬浮培养适应，建立了悬浮培养条件下基于转运蛋白过表达的分泌工程改造方法，为转运蛋白改造 CHO 细胞，提升全抗表达能力提供了有力支持。

    CHO 细胞； 蛋白质工程； SLY1 蛋白质类； MUNC18c蛋白质类； 贝伐单抗

    分泌表达是真核细胞表达基因工程重组蛋白的主要表达途径，在外源基因拷贝数及其转录水平达到瓶颈时，提高细胞分泌能力有助于重组蛋白表达量的提升。Sly1/Munc18(SM)蛋白是一类高度保守的囊泡转运蛋白家族，其中Sly1 调控囊泡由高尔基体至细胞膜的转运，而Munc18c则调控囊泡由内质网至高尔基体的转运[1]。已有研究表明在酵母和人细胞中过表达 SM 蛋白能够提高分泌蛋白的表达量[2]。研究人员把这种基于转运蛋白过表达的细胞改造称为“分泌工程化改造”[3]。

    本研究从人 HEK293FT 细胞中克隆s1 和18c基因，并构建含有 SM 基因的真核表达载体；然后将构建好的 SM 基因共表达质粒 pBSM 导入以贝伐单抗为报告基因的 CHO-AV 细胞株中，借以构建稳定过表达SM 基因的细胞株CHO-AV-SM。通过运用高通量筛选法获得外源蛋白表达量较高的工程细胞株，并对工程细胞株进行悬浮培养适应 ......