刘婕，陈俊亨，徐天殊，王丽萍，赵琦

    大容量人源Fab噬菌体展示抗体库的构建及抗CD276抗体筛选

    刘婕，陈俊亨，徐天殊，王丽萍，赵琦

    518055 深圳，中国科学院深圳先进技术研究院抗体药物研究中心(刘婕、陈俊亨、徐天殊、赵琦)；130012 长春，吉林大学生命科学学院(陈俊亨、徐天殊、王丽萍)

    构建大容量人源 Fab 噬菌体库，筛选并鉴定抗 CD276 的特异性抗体。

    通过采集 10 位健康成人的外周血淋巴细胞，提取总 RNA，利用 RT-PCR 扩增人 Fab 抗体基因片段，插入噬菌体载体 pCANTAB5H 中，构建人源 Fab 噬菌体抗体库。通过固相化的抗原对抗体库进行 3 轮筛选后，随机挑取96 个单克隆进行 phage-ELISA 鉴定，筛选出与抗原具有较强结合性的噬菌体克隆。

    成功构建库容为 5 × 1010的噬菌体抗体库，从中筛选到 11 株阳性克隆，对其进行测序鉴定，表明该 11 株克隆的序列均一致，ELISA 证实其对抗原 CD276 具有较强的结合性。

    构建了大容量人源 Fab 抗体库，从中获得具有抗 CD276 的人源 Fab 抗体片段，为进一步的研究和应用提供实验基础。

    免疫球蛋白 Fab 片段； 噬菌体展示抗体库； CD276

    CD276，又叫 B7-H3，是 2001 年在人树突状细胞 cDNA 文库中鉴定出的B7 超家族共信号分子[1]。近年来的研究表明共信号分子不仅能提供T 细胞活化所需的共信号分子促进 T 细胞免疫应答[2]，在抗炎和抗肿瘤免疫应答中发挥关键作用，同时也可以提供下调免疫应答的负性共信号分子，维持 T 细胞免疫耐受，在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用[3-5]。而 CD276 在正常组织、细胞中不表达或极低表达，高表达于多种肿瘤组织中[6]。本文以 CD276 为靶标，利用噬菌体抗体库技术克隆出全套人源抗体基因，并在噬菌体表面表达，构建大容量人源 Fab 抗体库，并从中筛选出特异性抗 CD276 的 Fab 抗体片段，为肿瘤药物的研制提供新的候选因子。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    噬菌体载体 pCANTAB5H 通过对商用载体 pCANTAB5E 进行酶切位点改造获得[7]；大肠杆菌 TG1 购自美国Lucigen 公司；HB2151 细菌由香港大学张美云教授惠赠；Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶和 T4 DNA 连接酶购自中国NEB 公司；Trizol、DNA 回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒购自德国 Qiagen 公司；RT-PCR 试剂盒购自美国Promega 公司；HRP 标记的鼠抗 Flag 抗体购自美国 Sigma 公司；HRP 标记的鼠抗 M13 抗体和淋巴细胞分离液购自美国 GE Healthcare 公司；CD276 蛋白购自美国R & D 公司；人外周血淋巴细胞来自 10 位健康人捐献的 2 L 外周血 ......