张娜，刘璐，窦玥莹，王真，宋丹青，李电东，邓洪斌

    载体介导的RNA干扰技术抑制肝癌细胞中糖原合成酶激酶3β表达的研究

    张娜，刘璐，窦玥莹，王真，宋丹青，李电东，邓洪斌

    目的 构建和筛选能高效、特异性抑制人 GSK-3β基因表达的 siRNA表达载体，探讨其对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。

    方法 提取人 L02细胞总 RNA，RT-PCR扩增 GSK-3β基因序列，克隆至 pSEB-HUS真核表达载体，构建 pSEB-G重组质粒。将设计、合成的 3条靶向 GSK-3β基因编码区的siRNA及阴性对照分别克隆至pSEB-G，构建siRNA表达载体 pSEB-si1-G、pSEB-si2-G、pSEB-si3-G及 pSEB-siN-G。将 siRNA表达载体瞬时转染 HepG2细胞，通过绿色荧光信号、RT-PCR和 Western blot观察和检测其对 GSK-3β基因的抑制效果，MTT实验和 caspase-3活性分析检测其对 HepG2细胞增殖和凋亡的影响。

    结果 经双酶切及测序证实，所构建 siRNA表达载体目的基因大小、序列与预期相符。瞬时转染 HepG2细胞后，其中的 pSEB-si1-G能使细胞中绿色荧光信号明显减少，可显著抑制 GSK-3β mRNA的表达及蛋白的合成，并使 HepG2细胞增殖明显降低，caspase-3活性显著升高。

    结论 成功构建了靶向 GSK-3β基因的 siRNA表达载体，沉默 GSK-3β能显著抑制 HepG2细胞的生长并诱导其发生凋亡。

    糖原合成酶激酶 3β； RNA干扰； 癌，肝细胞； siRNA表达载体

    糖原合成酶激酶 3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶，在肝细胞等真核细胞中广泛存在，于 20世纪 70年代末被发现和鉴定[1-2]。GSK-3β定位于染色体 3q13.3，主要由氨基端、激酶区和羧基端 3个结构域组成，其参与胰岛素、Wnt、Hedgehog以及Notch等多种信号传导通路，在调控细胞的增殖、分化、凋亡以及肿瘤发生等方面都发挥重要作用[3]。GSK-3β活性的紊乱促进包括肿瘤在内的多种疾病的发生和发展[4-5]。

    研究发现，GSK-3β在多种肿瘤中具有促进肿瘤生长的作用。如在 90%肾癌细胞核中发现存在GSK-3β的异常聚集，抑制 GSK-3β活性后可显著降低肾癌细胞的增殖与存活[6]。GSK-3β还可促进急性骨髓性白血病(AML)的发生[7] ......