刘星，孔建强

    ·综述·

    催化甾体羟基化的P450氧化酶BM3的蛋白质工程的研究进展

    刘星，孔建强

    甾体关键位点的羟基化在药用甾体的合成中发挥重要作用。为探究细胞色素 P450(CYP450)氧化酶 BM3 在甾体羟基化合成中的潜在应用，基于细胞色素 P450 BM3 的蛋白质工程逐渐发展起来。在取得的若干 P450 BM3 突变酶的基础上，通过新一代测序技术和生物信息学分析等方法，筛选出催化甾体羟基化的相关 CYP450。根据易错 PCR等定向进化技术获得了突变位点信息，进一步采用(饱和)定点突变等进化技术对活性氨基酸位点进行分析，再经过筛选获得既高于亲本酶也高于易错 PCR 技术得到的突变酶活力的新突变酶，并对突变体进行功能验证，进一步阐明甾体羟基化的可行性和重要性。此外，P450 BM3 催化底物和生成产物的选择性可以通过迭代的组合活性位点突变而改变。本文旨在探究近年来科研人员在 P450 氧化酶 BM3蛋白质工程催化甾体羟基化的改良领域中所做的尝试、获得的成果以及存在的问题，为 P450 BM3 羟基化疏水性甾体的深入研究提供理论依据。

    1 概述

    甾体药物在医药领域中占有重要地位，是仅次于抗生素的第二大类药物[1]，具有很强的抗过敏、抗感染、抗病毒等药理活性。除了薯蓣皂苷元在甾体药物中的广泛应用外，一些甾醇如胆固醇、谷甾醇和菜籽甾醇等现在也被认为是具有巨大潜能的甾体激素类药物的起始原料。CYP450 酶在甾体激素生物合成及代谢清除过程中起关键作用，而甾体激素也可影响 P450 酶的表达及代谢活性[2]。

    众所周知，甾体激素结构的微小变化，例如甾体母核的氧化状态，附加的官能团的类型、数量和立体位置[3]等会严重影响它们的生物活性。为了获得新颖的和更有活性的化合物，人们对甾类化合物进行了大量研究。在这些研究中，羟基化引起了人们越来越高的关注。羟基化增加了疏水性类甾体的极性，且羟基化的甾体通常比非羟基化的甾体具有更高的生物活性。甾体的羟基化主要是运用微生物全细胞催化法[3]，只有少数是使用分离的酶。细胞色素 P450 单加氧酶超家族是能催化甾体羟基化酶的典型代表，它们具有反应条件温和、环境友好、催化效率和选择性高等优势，能完全满足化学合成的要求[4-5]。

    甾体关键部位的羟基化提供了一个有效的获得珍贵药物代谢物、天然产物的衍生物和其他重要化合物的途径[6]。然而，由于 P450 酶的内在特性[7]，如需要合适的电子转移系统等，还不能进行大规模工业应用，但通过蛋白质工程得到的细胞色素 P450 BM3 及其突变体已经被报道能在不同的位置羟基化甾体 ......