何刘军，谢永丽，岑山，周金明

    ·论著·

    以KRAS为靶标的抗结肠癌药物筛选系统的构建及应用

    何刘军，谢永丽，岑山，周金明

    100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所免疫生物学室(何刘军、谢永丽、岑山、周金明)；321004 金华，浙江师范大学生化学院现代制药创新研究中心(谢永丽、周金明)

    构建以 KRAS 为靶标的抗结肠癌药物筛选系统，为抗结肠癌药物筛选提供新的技术手段。

    首先选取细胞系并确定系统的技术参数，构建以 KRAS 为靶标的抗结肠癌药物筛选系统，设计实验验证筛选系统的有效性；而后将构建的筛选系统初步应用，筛选化合物库 Z183593-L1200，并对筛选结果进行验证，验证筛选系统的可行性。

    完成筛选系统构建后，通过筛选系统(in-cell Western blot)测得的 Hce8693 和 T47D 细胞的 KRAS 表达差异与普通 Western blot 一致，筛选系统测定的 siRNA 系统的敲低效率与普通 Western blot 亦一致，筛选系统的有效性得到初步验证。筛选激酶抑制剂化合物库 Z183593-L1200 后，选取活性最好的化合物 PF-04691502 进行验证；浓度梯度实验显示，随着 PF-04691502 浓度升高则 KRAS 胞内含量降低，KRAS 胞内含量对 PF-04691502 浓度呈梯度依赖性；细胞增殖实验结果显示 PF-04691502 对 Hce8693 细胞的半数有效浓度(IC50)为 3.546 μmol/L，进一步验证了系统的可行性。

    所构建的以 KRAS 为靶标的抗结肠癌药物筛选系统具有一定有效性和可行性，能够用于以 KRAS 蛋白为药物靶点的药物高通量筛选，为抗结肠癌的药物研发提供了新的筛选方法。

    高通量模型； 结肠癌； KRAS； 近红外双色激光成像系统

    是一种原癌基因，长约 35 kb，位于12 号染色体，是基因(及)家族成员之一[1]。活化的表皮生长因子受体(EGFR)蛋白通过募集生长因子受体结合蛋白 2(GRB2)结合鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)促进 KRAS 蛋白的核苷酸交换，使其转化为活性 GTP 结合态。活化的 KRAS 会激活一系列的下游通路，尤其是 RAF/MEK/ERK 和 PI3K/AKT 通路，从而促进细胞分裂增殖和抑制细胞凋亡[2-3]。基因的激活突变可抑制 KRAS 蛋白的 GTPase 酶活性，和野生型 KRAS 蛋白相比降低 GTP 水解活性 3 ~ 9 倍[4] ......