姜华，刘丽，李路路，苗玉发，文海若，孙立，王欣，张颖丽，李伟，霍艳，耿兴超

    作者单位：100176 北京，中国食品药品检定研究院/国家药物安全评价监测中心药物非临床安全评价研究北京市重点实验室

    流式细胞术是当代最先进的细胞定量分析技术之一，在细胞分子水平上可通过荧光标记的单克隆抗体对单个细胞或其他生物因子进行多参数、快速、准确的定量分析。目前新药非临床研究中运用流式细胞仪进行实验动物外周血淋巴细胞及其亚群检测是新药安全性评价的重要组成部分，尤其是对于具有潜在免疫毒性的药物。T 淋巴细胞是淋巴细胞的重要类型，分为辅助性 T 淋巴细胞(T helper cells，Th)和细胞毒性 T 淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，可发挥细胞免疫及免疫调节等功能。测定 T 淋巴细胞亚群对于评价药物对机体免疫功能的影响有重要意义。T 淋巴细胞亚群检测结果主要与种属、性别、年龄、病原体感染、免疫状态等有关[1-4]，此外，用流式方法检测时涉及到多种处理因素，包括使用不同的荧光标记 CD3、CD4和 CD8 检测抗体，检测过程可能使用不同的血液抗凝剂、固定液，有无凝血、溶血情况，这些因素可能会对测定结果有影响。目前这方面的报道较少，并且很少在 GLP 实验室开展[5-7]。

    本研究在 GLP 实验室条件下分别应用两组不同的荧光标记检测抗体组合测定食蟹猴外周血 T淋巴细胞亚群；此外，分别采用流式试验中常用的两种抗凝剂肝素钠和乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)处理全血样本，通过比较不同条件下食蟹猴外周血 T 淋巴细胞亚群的测定结果，分析以上因素对检测结果的影响，为相关检测提供方法参考。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 实验动物 3～4 岁食蟹猴 320 只，雌雄各半，普通级，由广西桂东灵长类开发实验有限公司提供。动物生产许可证号为 SCXK(桂)2011-0001 和 SCXK(桂)2016-0001。饲养于国家药物安全评价监测中心的普通级动物房内，单笼饲养，自由饮水，每天定量给饲料和水果(各 150 g)，自由摄取。饲养温度和湿度分别控制在 16～26 ℃和 40%～70%，每小时换气次数不少于 8 次，照明时间是每天 12 h，饲养 3 周，适应环境后采血测定。

    1.1.2 仪器与试剂 FACSCalibur 流式细胞仪，分析软件 Cell QuestTM，流式仪校准微球(BD CalibriteTM 3-color、APC bead) ......