殷瀚，吴江，严子能，田广招，张铁元，马阳，王越，眭翔，刘舒云，郭全义

    由于不含血管、神经和淋巴，因此关节软骨的损伤修复能力极其有限，这也成为了临床科学研究和再生医学中的主要挑战[1-2]。目前，临床上对于关节软骨损伤患者的治疗方法主要包括自体骨软骨移植、同种异体骨软骨移植、自体软骨细胞移植、合成或生物支架植入(组织工程技术)、微骨折、粉碎软骨修复、生物制剂辅助治疗以及其他治疗。其中近些年发展起来的组织工程技术为关节软骨损伤的再生修复提供了新的可能。支架、种子细胞和生长因子是组织工程技术的三大要素。理想的支架材料是组织工程发展的重点[3]。

    天然生物材料由于具有优良的生物相容性，细胞毒性低，因此一直备受关注。软骨细胞外基质源性的支架，其成分和比例与天然的关节软骨相近。但因其来源有限、结构致密和脱细胞处理困难，因此限制了其作为组织工程技术的进一步发展与临床应用。

    人脐带是连接母体和胎儿的组织，在胎儿分娩后即作为废弃物被丢弃掉。华通胶是脐带的主要组成成分，其富含透明质酸、硫酸化糖胺多糖及胶原等成分，这些成分和天然软骨的成分相似，并且华通胶无血管、神经支配和淋巴[4-10]。同时，华通胶能够保护脐带的血管，防止脐带血管受外力挤压，避免脐带缺血。华通胶的此功能与关节软骨缓冲外力，减少变形、损伤和摩擦的作用相似。同时其属于医疗废弃物，来源广泛，不存在伦理问题。基于以上华通胶的生物学特征，其被认为是软骨组织工程支架材料的理想来源[11-13]。近年来，3D 生物打印作为新兴的技术，能够精确地制造出具有复杂结构的支架[14]。低温沉积打印技术作为 3D 生物打印技术的一种类型，具有能够打印出分级多孔支架的功能。

    为了更好地控制生物墨水的可打印浓度，制备出理想形状的支架，本实验前期将人脐带华通胶脱细胞处理，随后进行冷冻干燥，之后利用低温沉积3D 生物打印技术，制造出分级多孔的脱细胞华通胶细胞外基质支架，系统评价该支架的物理化学特性、生物相容性和对干细胞成软骨分化的影响，为体内软骨修复实验提供理论依据。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 人脐带 正常足月妊娠新生儿脐带由解放军总医院妇产科提供，已获得知情同意。SD 大鼠乳鼠 5 只，重 12～18 g，许可证号：SCXK(京)2019-0010；实验方案由中国人民解放军总医院动物实验伦理委员会批准。

    1.1.2 实验用细胞、试剂及仪器 大鼠骨髓间充质干细胞由解放军总医院骨科研究所提供；DMEM/F-12 培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗购自美国 Gibco 公司；0.25% 胰蛋白酶购自美国 Sigma 公司；Actin 微丝绿色荧光探针购自上海碧云天生物技术有限公司；甲苯胺蓝染色试剂盒、苦味酸-天狼猩红染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；苏木精-伊红染色(HE)液购自北京瀚海拓新生物技术有限公司；CCK-8 试剂盒购自美国Abmole 公司；多聚甲醛购自天津市光复精细化工研究所；氢氧化钠(NaOH)和冰醋酸购自天津市福晨化学试剂有限公司；引物购自上海生工生物公司；OriCell 骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒购自赛业公司；ReverTra Ace qPCR RT Master Mix 购自德国 Toyobo 公司 ......