贾松华，邓海清，杜闪，张艳红，尹珊珊，刘建凯

    流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae，Hi)为革兰氏阴性杆菌，隶属嗜血杆菌属，威胁的主要人群为 5 岁以下儿童，是全球严重的公共卫生问题。在常规使用疫苗前，流感嗜血杆菌造成的所有侵入性疾病中 95% 是由 b 型流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae type b，Hib)引起[1-3]。多聚磷酸核糖基核糖醇(polyribosylribitol phosphate，PRP)是 b 型流感嗜血杆菌荚膜多糖的主要组成部分，也是制备 Hib 疫苗有效的抗原成分[4]，结构见图 1。本公司制备的 Hib 结合疫苗通过将纯化的PRP 与破伤风类毒素(tetanus toxoid，TT)共价结合为结合态多糖，增加了 Hib 疫苗的免疫原性，将免疫应答类型由 T 细胞非依赖性转换为具有免疫记忆的 T 细胞依赖性免疫应答，对于预防 Hib引起的脑膜炎及肺炎等疾病具有重要意义。在 Hib结合疫苗中，与载体蛋白结合的处于结合态的PRP，即为 Hib 结合态多糖；而未与载体蛋白结合的处于游离状态的 PRP，即为 Hib 游离多糖。Guo 等[5]研究结果表明游离多糖含量高的 Hib 疫苗免疫小鼠的抗体水平差。多项研究表明，Hib 游离多糖含量是评价疫苗效价的重要质量控制指标，Hib 游离多糖含量过高会显著影响疫苗的免疫原性[1,5-6]。

    目前，《中华人民共和国药典》2020 版(三部)(简称《中国药典》)推荐使用乙醇分步沉淀法[7]测定 Hib 结合疫苗中的游离多糖含量。乙醇分步沉淀法作为测定游离多糖含量的经典方法，其稳定性、线性、准确度、精密度等均得到广泛验证，但该方法操作繁琐，操作要求高，且试验周期长，对于游离多糖含量低的样品，可能因含量低于测定下限造成误差[6]。高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detector，HPAEC-PAD)用于检测 Hib 疫苗中多糖含量备受关注。本实验拟利用 HPAEC-PAD 法测定冻干 Hib 疫苗游离多糖含量，探讨不同条件对供试品水解效果的影响，最终确定了最佳水解条件，并初步确定冻干 Hib 结合疫苗中游离多糖含量分离的最适方法。为 Hib结合疫苗的游离多糖质量控制提供了参考，为疫苗中该项测定提供了检测方法。

    1 材料与方法

    1.1 材料 ......