乌梅丸对胃肠感染模型小鼠血浆Th1、Th2淋巴细胞因子和胃肠传输功能的影响(1)
摘要目的：观察乌梅丸对胃肠感染模型小鼠的疗效，同时探讨其对小鼠血浆辅助性T细胞1(Th1)、辅助性T细胞2(Th2)淋巴细胞因子和胃肠传输功能的影响。方法：选取昆明小鼠30只并随机分为空白组、模型组及实验组，各10只。其中模型组及实验组小鼠接受致病性大肠杆菌(EPEC)灌胃制作感染性腹泻模型，空白组用同等剂量生理盐水灌胃。模型制备成功后实验组每日用乌梅丸水溶性生物碱灌胃，剂量按照按人/鼠公斤体重的等效剂量换算，空白组及模型组用同等剂量的生理盐水灌胃，连续干预10 d。比较3组胃排空率、小肠推进率、外周血Th1、Th2淋巴细胞因子表达的变化。结果：模型组及实验组小鼠外周血白细胞计数、中性粒细胞百分比较空白组升高，差异有统计学意义(P<0.05)，其中实验组较模型组降低(P<0.05)。3组淋巴细胞百分比差异无统计学意义(P>0.05)。模型组及实验组小鼠的胃排空率及小肠推进率明显增强，与空白组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，其中实验组小鼠的胃排空率及小肠推进率明显较模型组快慢，差异有统计学意义(P<0.05)。与空白组比较，模型组及实验组小鼠外周血Th2比例、白细胞介素(IL4)、IL6、IL10明显增高，但实验组水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，模型组及实验组Th1比例、IL2、肿瘤坏死因子ɑ(TNFɑ)、干扰素γ(IFNγ)表达较空白组明显升高，但模型组及实验组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论：乌梅丸可有效改善胃肠感染模型小鼠的胃肠传输功能，其作用机制可能与介导机体的体液免疫为主。
关键词胃肠感染模型;胃肠传输功能;乌梅丸;辅助性T细胞1;辅助性T细胞2
中图分类号：R289.4文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.018
感染性疾病在胃肠道疾病占首要位置，其中大肠杆菌发病率较高。辅助性T细胞1(Th1)、辅助性T细胞2(Th2)是淋巴细胞CD4+T的主要亚群，有研究显示发生胃肠感染时机体的免疫系统功能受到明显破坏[12]，其中Th1及Th2的水平变化贯穿疾病的发生发展过程。乌梅丸是《伤寒论》中治疗蛔厥的经典方，其君药乌梅性平味酸涩，入肺肠两经，有显著的收敛效应，并可涩肠道生津，临床不乏其有效治疗胃肠道疾病的记载[36]，但其作用机制目前尚无统一定论。基于此，我们利用胃肠感染模型小鼠，探析乌梅丸的部分药用机制。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1动物选取昆明小鼠30只，雌雄各半，购买自济南金丰实验动物有限公司(许可证号：SCXX(沪)201100241)，本研究方案经过本院伦理委员会批准进行，所有动物饲养于本院动物实验中心，饲养条件：温度(23.5±0.5)℃湿度(52±1.5)%，以12/12 h为光暗周期。
1.1.2药物乌梅丸粉由本院中药研究院提供，组成：乌梅300枚，细辛84 g、干姜140 g、黄连224 g、当归56 g、附子84 g(去皮，炮)、 蜀椒56 g(出汗)、桂枝84 g(去皮)、人参84 g、黄柏84 g，以上10味，各捣筛，混合和匀;以苦酒渍乌梅12 h，去核，蒸熟捣成泥，与蜜组成丸。
1.1.3试剂与仪器致病性大肠杆菌(EPECE2348/69)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，乌梅丸粉由本院中药研究院提供，小鼠T淋巴细胞因子CBA试剂盒购自北京西美杰科技有限公司，CytoFLEX LX流式细胞仪购自贝克曼库尔特商贸有限公司，血细胞分析仪购自北京宝灵曼阳光科技有限公司。白细胞介素2(IL2)、IL6、IL10、IL4、肿瘤坏死因子ɑ(TNFɑ)、干扰素γ(IFNγ)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购自美国CST公司。
1.2方法
1.2.1分组与模型制备
选取昆明小鼠30只，随机分为空白组、模型组及实验组，各10只。3组小鼠在体重、鼠龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。参考文献[7]中EPEC致胃肠感染模型制备方法，使用0.3 mL的3%碳酸氢钠溶液对模型组及实验组小鼠进行灌胃，30 min后将事先配制好的浓度为5×108cfu/mL的致病性EPEC混悬液再次灌胃，每只小鼠灌胃0.5 mL致病性EPEC混悬液，随后回笼饲养，观察小鼠的大便变化情况。空白组小鼠接受等剂量的生理盐水灌胃后回笼饲养。灌胃6 h后小鼠出现精神疲乏、活动减少、大便性状改变提示造模成功。
1.2.2干预方法
实验组小鼠造模成功后每日灌胃乌梅丸水溶液，剂量按人/鼠公斤体重的等效剂量计算，1次/d，连续干预10 d。模型组及空白与等体积蒸馏水灌胃。
1.2.3检测指标
1)胃排空率、小肠推进率：将3组小鼠禁食12 h，按照0.1 mL/10 mg的比例计算活性炭剂量，将计算好的活性炭进行灌胃，随后处死小鼠取胃称重。将胃置于冰上后从胃大弯处剪开胃体，用生理盐水冲洗胃内容物后再次称重，计算胃排空率。再剪取肠管测量小肠总长度，从幽门至活性炭前沿的距离视为肠管内推进距离，计算小肠推进率。
2)Th1及Th2淋巴细胞因子的表达：干预结束取3组小鼠眼眶静脉血，分离出单核细胞，将分离出的单核细胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养4～6 h，培养过程中加入佛波醇乙酯(PMA)及离子霉素、莫能霉素混合而成的工作液体进行刺激，随后将细胞收集后加人5 μL异硫氰酸荧光素标记的CD4(CD4FITC)，操作按试剂盒说明书进行，采用流式细胞仪检测Th1及Th2细胞。
3)IL4、IL2、IL6、IL10、TNFɑ、IFNγ检测：在4 ℃条件下进行3 000×g离心5 min后用高压枪头吸取离心后的上清液，使用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行检测，利用抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合原理进行相关因子浓度的检测，具体步骤如下：用0.05 mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10 μg/mL。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1 mL缓冲液，4 ℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，3 min/次。将一定稀释的待检样品0.1 mL加入反应孔中，置37 ℃孵育1 h。然后洗涤。同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔。随后在各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1 mL。37 ℃孵育0.5～1 h，洗涤。再于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1 mL，37 ℃10～30 min。于各反应孔中加入2 mol/L硫酸0.05 mL。試剂盒由广州达安基因股份有限公司提供，显色后采用492 nm波长，TMB反应产物检测需要450 nm波长。检测时一定要首先进行空白孔系统调零，用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示。以空白对照孔调零后测各孔A值，若大于规定的阴性对照A值的2.1倍，即为阳性。操作过程全部按照试剂盒说明书进行检测。, 百拇医药(陈志彪 葛俊辰)
关键词胃肠感染模型;胃肠传输功能;乌梅丸;辅助性T细胞1;辅助性T细胞2
中图分类号：R289.4文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.018
感染性疾病在胃肠道疾病占首要位置，其中大肠杆菌发病率较高。辅助性T细胞1(Th1)、辅助性T细胞2(Th2)是淋巴细胞CD4+T的主要亚群，有研究显示发生胃肠感染时机体的免疫系统功能受到明显破坏[12]，其中Th1及Th2的水平变化贯穿疾病的发生发展过程。乌梅丸是《伤寒论》中治疗蛔厥的经典方，其君药乌梅性平味酸涩，入肺肠两经，有显著的收敛效应，并可涩肠道生津，临床不乏其有效治疗胃肠道疾病的记载[36]，但其作用机制目前尚无统一定论。基于此，我们利用胃肠感染模型小鼠，探析乌梅丸的部分药用机制。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1动物选取昆明小鼠30只，雌雄各半，购买自济南金丰实验动物有限公司(许可证号：SCXX(沪)201100241)，本研究方案经过本院伦理委员会批准进行，所有动物饲养于本院动物实验中心，饲养条件：温度(23.5±0.5)℃湿度(52±1.5)%，以12/12 h为光暗周期。
1.1.2药物乌梅丸粉由本院中药研究院提供，组成：乌梅300枚，细辛84 g、干姜140 g、黄连224 g、当归56 g、附子84 g(去皮，炮)、 蜀椒56 g(出汗)、桂枝84 g(去皮)、人参84 g、黄柏84 g，以上10味，各捣筛，混合和匀;以苦酒渍乌梅12 h，去核，蒸熟捣成泥，与蜜组成丸。
1.1.3试剂与仪器致病性大肠杆菌(EPECE2348/69)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，乌梅丸粉由本院中药研究院提供，小鼠T淋巴细胞因子CBA试剂盒购自北京西美杰科技有限公司，CytoFLEX LX流式细胞仪购自贝克曼库尔特商贸有限公司，血细胞分析仪购自北京宝灵曼阳光科技有限公司。白细胞介素2(IL2)、IL6、IL10、IL4、肿瘤坏死因子ɑ(TNFɑ)、干扰素γ(IFNγ)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购自美国CST公司。
1.2方法
1.2.1分组与模型制备
选取昆明小鼠30只，随机分为空白组、模型组及实验组，各10只。3组小鼠在体重、鼠龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。参考文献[7]中EPEC致胃肠感染模型制备方法，使用0.3 mL的3%碳酸氢钠溶液对模型组及实验组小鼠进行灌胃，30 min后将事先配制好的浓度为5×108cfu/mL的致病性EPEC混悬液再次灌胃，每只小鼠灌胃0.5 mL致病性EPEC混悬液，随后回笼饲养，观察小鼠的大便变化情况。空白组小鼠接受等剂量的生理盐水灌胃后回笼饲养。灌胃6 h后小鼠出现精神疲乏、活动减少、大便性状改变提示造模成功。
1.2.2干预方法
实验组小鼠造模成功后每日灌胃乌梅丸水溶液，剂量按人/鼠公斤体重的等效剂量计算，1次/d，连续干预10 d。模型组及空白与等体积蒸馏水灌胃。
1.2.3检测指标
1)胃排空率、小肠推进率：将3组小鼠禁食12 h，按照0.1 mL/10 mg的比例计算活性炭剂量，将计算好的活性炭进行灌胃，随后处死小鼠取胃称重。将胃置于冰上后从胃大弯处剪开胃体，用生理盐水冲洗胃内容物后再次称重，计算胃排空率。再剪取肠管测量小肠总长度，从幽门至活性炭前沿的距离视为肠管内推进距离，计算小肠推进率。
2)Th1及Th2淋巴细胞因子的表达：干预结束取3组小鼠眼眶静脉血，分离出单核细胞，将分离出的单核细胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养4～6 h，培养过程中加入佛波醇乙酯(PMA)及离子霉素、莫能霉素混合而成的工作液体进行刺激，随后将细胞收集后加人5 μL异硫氰酸荧光素标记的CD4(CD4FITC)，操作按试剂盒说明书进行，采用流式细胞仪检测Th1及Th2细胞。
3)IL4、IL2、IL6、IL10、TNFɑ、IFNγ检测：在4 ℃条件下进行3 000×g离心5 min后用高压枪头吸取离心后的上清液，使用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行检测，利用抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合原理进行相关因子浓度的检测，具体步骤如下：用0.05 mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10 μg/mL。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1 mL缓冲液，4 ℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，3 min/次。将一定稀释的待检样品0.1 mL加入反应孔中，置37 ℃孵育1 h。然后洗涤。同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔。随后在各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1 mL。37 ℃孵育0.5～1 h，洗涤。再于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1 mL，37 ℃10～30 min。于各反应孔中加入2 mol/L硫酸0.05 mL。試剂盒由广州达安基因股份有限公司提供，显色后采用492 nm波长，TMB反应产物检测需要450 nm波长。检测时一定要首先进行空白孔系统调零，用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示。以空白对照孔调零后测各孔A值，若大于规定的阴性对照A值的2.1倍，即为阳性。操作过程全部按照试剂盒说明书进行检测。, 百拇医药(陈志彪 葛俊辰)
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