1.3.5 蛋白质印迹(westernblotting)法 取收集的组织200 mg，加入1 mL含蛋白酶抑制剂(PMSF)裂解缓冲液于冰上进行匀浆，4 ℃，15 000 r/min离心5 min，取上清液，100 μL分装后-80 ℃备用。根据DAB方法对所提蛋白液进行浓度测定。以100 μL蛋白液中加入25 μL的上样缓冲液于100 ℃金属浴中变性。按照，每泳道上样量为50 μg蛋白，计算上样量。电泳(4%浓缩胶，12%分离胶，120 V，50 mA，1.5 h)结束后将凝胶取出，用PVDF膜转印，遵循胶在负极，膜在正极的原则，50 V，100 mA，2 h。5%脱脂奶粉液的封闭2 h，TBS洗3次，5 min/次，分别加入5%脱脂奶粉按1∶1 000稀释的抗CRHR1和β-actin抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBS洗3次，5 min/次，加入碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG(1∶2 000)室温2 h，TBS洗3次，5 min/次。将滤膜放人配好的显色液中显色15～30 min ......