联合蛋白质组学和代谢组学探讨兔脊髓缺血再灌注损伤的时间规律
1蛋白组学方法,1仪器,2试剂,3实验方法,4结果,5Western-blot验证分析,2代谢组学方法,1材料与方法,2结果,3讨论
苑福升 ,刘 健 ,高 琦 ,朱本清 ,王海涛 ,闫 鹏 ,杨小玉1.吉林大学中日联谊医院骨科,吉林长春 130021;2.天津人民医院骨科,天津 300211
脊髓缺血再灌注损伤是脊柱脊髓外科领域研究的热点,以往的研究主要集中在阐述机制、解释空间构造方面。我们建立蛋白组学和代谢组学联合研究平台,试图从新的角度阐释脊髓缺血再灌注损伤时间规律。
1 蛋白组学方法
1.1 仪器
Amersham公司IPGphor等电聚焦仪、Ettan DALT Twelve电泳系统、蛋白核酸分析仪、超声破碎仪。Beckman冷冻离心机,PROTEAN IEF cell型等电聚焦仪、PROTEAN-11(R)ⅪCell型垂直电泳槽、凝胶成像系统为Bio-Rad产品,Thermo冷凝水循环仪质谱仪,Applied Biosystems产品ABI-4800型反射式基质辅助激光解吸附飞行时间串联质谱,Typhoon 9410扫描仪及图像分析软件DeCyder v.5.02(Amersham Bioscience)。
1.2 试剂
Cy2、Cy3、Cy5荧光染料购自Amersham公司;DMF购于SIGMA 公司;裂解液(7 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、4%CHAPS)、水化液(8 mol/L尿素、2%CHAPS)、平衡母液(6 mol/L尿素、50mmol/L Tris-HCl、20%甘油、2%SDS)、RCDC 定量试剂盒、10× 电 泳 缓 冲 液 (250 mmol/L Tris、1.92 mol/L glycine、1%SDS)、Bradford定量试剂盒、30%丙烯酰胺(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺=29∶1)、1.5 mol/L Tris-HCl (pH 8.8)、10%SDS 均是Bio-Rad公司产品。
1.3 实验方法
1.3.1 模型制备和脊髓标本采集 清洁级健康成年新西兰大白兔由吉林大学实验动物中心提供,雌雄不限,体重2.5~3.0 kg。随机将实验动物分3组:假手术组(I0R0)、缺血30 min组(I30R0)、缺血再灌组(I30R6、12、24、48),每组 6 只。 将其用10%的水合氯醛麻醉,开腹后用血管夹在左肾动脉分叉下阻断腹主动脉,使脊髓腰骶段缺血。假手术组和缺血30 min组于术后麻醉下取脊髓L4~5节段,缺血再灌注组缺血30 min后去除血管夹闭创,模拟再灌注。再灌注6、12、24、48 h麻醉下活体取脊髓L4~5节段 ......
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