RNAi抑制促血管形成因子治疗结肠癌的研究
微血管,质粒,1材料与方法,1实验材料,2ShRNA表达质粒的构建,3肿瘤细胞悬液的制备,4裸鼠的肿瘤接种,5裸鼠的分组,6肿瘤的治疗及观察指标,7统计学方法,2结果,1肿瘤生长曲线,2肿瘤基因治疗后各治疗组Del1
齐 霁 ,邹小龙1.北京市中西医结合医院消化内科,北京 100029;2.哈尔滨医科大学附属第一临床医院普外科,黑龙江 哈尔滨 150081
肿瘤的发生和发展是多因素、多基因相互作用的结果。传统基因治疗技术一般是在基因水平特异性地诱导单个癌基因失活,即基因治疗只通过对某一个癌基因进行抑制从而起到治疗作用,但是对于多基因致病的肿瘤来说,仅对其中某个基因实现基因沉默很难达到预期的疗效。与此同时,基因治疗是指在转录水平诱导基因发生沉默,这种治疗的生物安全性较差。而技术日趋成熟的RNA干扰(RNAi)技术的不断发展和完善为解决传统基因治疗的生物安全性问题提供了一种可能。RNAi是一种基因转录后沉默技术,这种技术不仅可以产生类似于基因敲除的效果,又不会对目标DNA序列产生任何遗传上的改变。由于RNA干扰序列具有很强的序列特异性,因此在RNA干扰序列设计的过程中可以利用同一基因家族中的多个基因具有同源性很高的一段保守序列这一特性,设计出针对某些序列的特异siRNA分子。而后通过注射设计好的siRNA使同源基因产生基因沉默效应,同时,与传统的基因治疗相比,这种RNAi对机体其他的基因产生不良影响较少[1]。RNAi技术具有较高的稳定性和基因沉默的效率,而且将siRNA进一步地加以修饰就可以有效地避免核酸酶的降解,使其更稳定地发挥作用,从而实现对90%以上的基因进行沉默。综上所述,RNAi技术在肿瘤的病因研究和靶向治疗等方面具有明显的优势。因此,充分发挥RNAi技术的优势对于肿瘤研究和治疗有着举足轻重的作用。本课题组之前的研究发现,Del1和VEGF分属于不同类别的促血管形成因子,这两类因子在结肠癌的肿瘤血管生成方面具有协同的促进作用[2]。本实验使用RNAi抑制促血管形成因子基因的表达,观察结肠癌的基因治疗效果,从而明确RNAi抑制促血管形成因子的基因治疗方式对结肠癌治疗效果的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料
5周龄BALB/C裸鼠(nu/nu)60只,购于上海伊莱克斯实验动物有限责任公司。Del1和VEGF基因shRNA表达质粒和阴性对照质粒由武汉晶赛公司构建合成。
1.2 ShRNA表达质粒的构建
Del1和VEGF基因shRNA表达质粒和阴性对照质粒由武汉晶赛公司构建合成。四条针对Del1基因(Genbank HSU7_0312)不同靶点的shRNA筛选设计后构建于同一个质粒中,四条shRNA的序列为:AATGGAGGTATCTGTTTGC CA(207~227nt);GTTCAGTGTTGTGGAGGT(286~304nt);AAGC ATACCGG-GGGATACAT (388~408 nt);AATGTCATCGACCTCCCATC(1443~1463 nt) ......
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