靶向舌癌Tca8113细胞血管内皮细胞生长因子基因的siRNA表达载体构建及体外抑制作用
测序,1材料与方法,2方法,3统计学方法,2结果,1重组载体酶切鉴定,2重组载体基因测序,3免疫组织化学染色SABC法分析Tca8113细胞血管内皮细胞生长因子蛋白表达
姚志文 刘 唯 程由勇 李红玖 李春华 于大海1.广州医学院附属深圳沙井医院口腔科,广东 深圳 518104;2.广西医科大学口腔医学院,广西 南宁 530021021
血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)能促进舌癌(carcinoma of tongue)中血管的生成,与舌癌的生长与转移密切相关[1-2],抑制VEGF基因的表达可望抑制舌癌血管的生成,从而抑制舌癌细胞的增殖和转移。本研究以VEGF基因为靶点,构建VEGF-siRNA表达载体,转染舌癌Tca8113细胞,研究其对Tca8113细胞VEGF基因表达的抑制作用。
1 材料与方法
1.1 材料
Tca8113细胞株(四川大学口腔疾病研究国家重点实验室),Psilencer 2.1-U6-neo真核表达载体(美国 Ambion公司),脂质体 Lipofectamine 2000(美国 Invitrogen 公司),质粒小剂量提取试剂盒(美国Omega公司),大肠杆菌DH5α(武汉晶赛生物公司),G418试剂(美国Gbico公司),人VEGFELISA试剂盒 (上海森雄科技实业有限公司),限制性内切酶、T4 DNA连接酶 (美国NEB公司),HRP标记兔抗人的IgG抗体(美国Gbico公司),鼠抗人VEGF的单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)。
1.2 方法
1.2.1 血管内皮细胞生长因子基因特异的siRNA表达载体构建 根据基因数据库已知VEGF mRNA序列,参考siRNA的设计有关文献[3],设计针对VEGF基因不同剪切子的公共靶点,根据所选靶点人工合成VEGF基因RNAi靶序列(5′-GATAGAGCAAGACAAGAAA-3′)及其互补的反义链。以及一条实验对照序列(即无关序列HK:5′-GACTTCATAAGGCGCATGC-3')及其互补的反义链 ......
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