HPLC法测定复方α酮酸片中四种氨基酸的含量
苏氨酸,赖氨酸,1仪器与试药,2样品,3试剂,2方法与结果,1衍生化试剂的制备,2流动相的选择,3色谱条件,4衍生化反应的条件,5含量测定方法学考察,6结果,3讨论
蒋 燕 陆继好1.无锡卫生高等职业技术学校,江苏无锡 214111;2.无锡信孚医药技术有限公司,江苏无锡 214028
复方α-酮酸是2000年和2004年国家医保目录品种以及国家基本药物(2004年),临床应用于慢性肾衰患者的营养,延缓肾衰进展,纠正代谢紊乱,复方α-酮酸的口号是:拨慢肾衰进展的时钟。它由4种酮酸、1种羟酸和5种必需氨基酸配方制成,其中酮酸和羟酸以钙盐形式存在。酮酸或羟酸经过酶的转氨基作用合成相应的必需氨基酸,同时尿素氮被降减,通过再利用含氮代谢产物减少尿毒症毒素的蓄积,改善尿毒症症状;通过肾小球的高滤过,降低血磷和PTH水平延缓慢性肾衰的进程,从而推迟开始透析的时间;补充必需氨基酸则纠正基酸代谢紊乱,改善营养状况[1]。复方α-酮酸片中5种氨基酸除色氨酸外其他均无紫外吸收的特征,文献资料大多采用柱前衍生法,以邻苯二甲醛(OPA)和2-巯基乙醇为衍生化试剂,室温碱性条件下(PH约9.5)迅速产生本品的一级氨基酸反应,生成具有强荧光的产物1-硫代-2-烷基-异吲哚(紫外波长 335 nm,荧光波长 λEx=340 nm,λEm=450 nm)[2-10]。文献方法有5种氨基酸一次性测定方法,由于5种氨基酸的极性相差较大,此方法无法兼顾所有峰的峰形,易产生较大的测量误差,参照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版二部附录ⅤD),选用最常用的紫外检测器测定含量,建立4种氨基酸的HPLC测定方法,经方法学研究,该方法准确方便,适合复方α-酮酸片中氨基酸的质量控制。
1 仪器与试药
1.1 仪器
高效液相色谱仪 (日本岛津公司):SPD-10AVP紫外检测器;LC 10ATVP梯度泵,AT-130柱温箱。
1.2 样品
复方-α 酮酸片(开同片),批号:20060701、20060702、200 60703,江苏信孚药业有限公司;对照品:苏氨酸(Thr)、组氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)、醋酸赖氨酸(Lys-HAc)的含量均不少于99.0%。
1.3 试剂
乙腈为色谱纯;无水醋酸钠、冰醋酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠、碳酸氢钠、邻苯二甲醛(OPA)和2-巯基乙醇为分析纯;水为重蒸馏水。
2 方法与结果
2.1 衍生化试剂的制备
精密称取邻苯二甲醛(OPA)0.025 g,用甲醇1 mL溶解,加 2-巯基乙醇 100μL,0.4 mol/L硼酸溶液(PH 9.5 ......
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