方 庆 朱庆丰 尹国才 陈新生

    1.安徽医科大学附属安庆医院神经外科，安徽 安庆 246003；2.安庆师范学院生命科学系，安徽 安庆 246003

    中枢神经系统的许多疾病都存在不同程度和方式的神经细胞缺失或变性死亡，并由此引起神经功能的损害。传统的治疗效果多不显著，神经干细胞(NSCs)的发现与移植研究为其治疗带来了新的思路和方法。本研究旨在探索人胎脑神经干细胞的体外分离培养条件，从而在体外大量增殖神经干细胞，并观察神经干细胞增殖和分化的特点。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    水囊引产的14周妊娠胎儿1例，由临床科室提供，孕妇自愿捐献，对其使用遵守医学伦理原则并经医院伦理委员会批准。

    1.2 主要试剂

    DMEM/F12(1：1)培养基、B27、N2、碱性成纤维生长因子(bFGF)(Gibco 公司)、 表皮生长因子 (EGF)(Invitrogen 公司)、鼠抗人巢蛋白(Nestin)单克隆抗体、FITC标记的山羊抗小鼠IgG(Bdbioscience公司)、鼠抗人神经特异烯醇化酶(NSE)单克隆抗体、鼠抗人胶质纤维酸性蛋白(GFAP)单克隆抗体(Neomarkers公司)。

    1.3 实验方法

    1.3.1 取材及原代细胞培养 取14周水囊引产的人胚胎，无菌条件下取海马组织，用D-Hanks液漂洗，剪成1 mm3大小的组织块，经0.25%胰蛋白酶消化15 min，用200目不锈钢细胞筛，去除大块组织，离心后收集沉淀细胞，将其重悬于含B27(1∶50)、N2(1∶100)、EGF(20 ng/mL)、bFGF(20 ng/mL)的DMEM/F12培养液中。记数细胞活力后，按2×105/mL接种密度于T25细胞培养瓶，37℃、5%CO2静置培养，每天观察细胞的生长状况，3 d半量换液1次。

    1.3.2 细胞传代培养 传代时，将神经细胞球收集于离心管经0.125%胰酶2 min，1000 r/min离心5 min后加入新鲜的全培养基，用移液器吹打10～15次，计数并以2×105个/mL细胞密度接种于T25细胞培养瓶中 ......