刘海燕 曹海涛 常玉梅 徐 鹏

    1.解放军第252医院中心实验室，河北保定 071000；2.解放军第252医院医务处，河北保定 071000

    腹泻是一种常见病，引起腹泻的原因有多种，大致可分为感染性腹泻和非感染性腹泻，其中感染型腹泻占比较高。感染性腹泻常见的病原菌包括细菌、病毒、真菌、原虫等，其中又以细菌感染为主要感染类型，尤其是在成人腹泻中发生率高。人体菌群失调与腹泻可能存在着某种程度上的因果关系，不同类型的腹泻可能对应着程度不同的菌群数量变化[1-3]。临床上目前大多采用传统的肠道菌群分析方法，需要不同的细菌培养技术，然后进行生化反应鉴定，多种病原菌需要复杂的营养条件，培养操作费时、费力，而且大多数微生物不能很好地培养出来，容易造成假阴性和数量上的偏差，没有成熟的方法完整准确地反映肠道微生物群落的组成情况，采用荧光定量PCR、ERIC-PCR指纹图谱法等分子生态学的方法可有效解决这个问题[4-5]。

    1 材料与方法

    1.1 样品采集

    粪便有白细胞患者(腹泻组)及正常对照者(对照组)，粪便样品为2013年7～9月采自解放军第252医院门诊部。腹泻组选自门诊消化科就诊的腹泻患者，对照组选自门诊体检人员，均采自就诊当日，所有样品采集后立即提取基因组DNA，-20℃冷冻保存。所有患者留取粪便标本前均未应用抗生素或微生态制剂。对照组留取粪便标本前2周内无消化道不适症状，且未应用抗生素或微生态制剂。患者资料见表1。

    表1 两组一般资料情况

    1.2 主要仪器及试剂

    粪便基因组DNA提取试剂盒、SYBR Green荧光染料试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司，DNA纯化试剂盒、DNA Marker、琼脂糖、PCR 2×PCR Mix购自北京康为世纪生物科技有限公司，实验所需引物为北京天一辉远合成，PCR仪为美国伯乐公司的MyCycler，荧光定量PCR仪为美国AB公司的ABI 7500。

    1.3 方法

    1.3.1 粪便标本前处理及细菌DNA的抽提 称取2 g粪便加入18 mL无菌PBS，振荡10 min形成粪浆，均匀吸取0.2 g粪浆标本用DNA缓冲液处理，间歇振荡1 min至样本混匀。取上清200 μL ......