罗琦 刘凯

    陕西省宝鸡市第二人民医院骨科，陕西宝鸡721000

    细胞团块悬浮培养法对兔关节软骨细胞表型维持效果的研究

    罗琦刘凯

    陕西省宝鸡市第二人民医院骨科，陕西宝鸡721000

    目的探索并构建一种操作相对简便、成本较低，且能够较好维持关节软骨细胞表型的体外培养扩增体系。为建立表型稳定的关节软骨细胞库提供新思路。方法改良式三步酶解消化法获取兔关节软骨细胞作为原代种子细胞。分别进行常规单层贴壁培养法扩增传代和细胞团块-悬浮培养并传代。流式细胞仪法对比两种培养体系软骨细胞生长动力学特点。免疫组化技术和Western bolt法对比两种培养体系中次代软骨细胞标志性产物Ⅱ型胶原蛋白的表达情况。结果①兔关节软骨细胞在常规单层贴壁培养体系中扩增较快，但迅速失去圆形外观，并逐渐形成类似于纤维细胞样的长梭形外观，即发生去分化现象。免疫组化染色和Western bolt检测结果显示，Ⅱ型胶原蛋白的表达能力随着传代次数增加而递减，到P4代细胞基本不表达。②悬浮培养培养软骨细胞扩增较慢，其生长曲线近似于原代软骨细胞。各代细胞聚集成团，最大可获得直径约4 mm的软骨细胞团块，单个细胞保持圆形或类圆形外观。各代细胞的Ⅱ型胶原蛋白表达水平基本稳定，并可在细胞周围形成含有Ⅱ型胶原蛋白的类似于细胞外基质样结构。结论悬浮培养模式较为接近软骨细胞的生理条件，可获得表型较稳定的关节软骨子代细胞，并保持了Ⅱ型胶原蛋白合成和分泌能力，可能作为软骨组织工程研究的种子细胞来源之一。

    透明软骨；去分化；悬浮培养；组织工程

    足够数量的表型正常的关节软骨细胞是软骨组织工程和软骨相关研究的基础。但是，在常规贴壁式单层培养体系中，关节软骨细胞因生长条件的变化和细胞外基质的缺失，导致子代细胞难以维持相对正常的表型。该现象已成为限制软骨组织工程领域研究和临床应用的瓶颈问题之一。为解决这一问题，国内外学者进行大量探索，以求尽可能模拟接近生理条件的关节软骨细胞培养系统。其中较为成功的培养模式包括生物反应器培养以及构建各种生物支架培养模式。但往往因设备费用昂贵、操作过程复杂及支架材料获取相对困难等诸多因素影响其广泛应用[1，4，5，9]。

    本研究在总结前人研究经验的基础上，通过改良三步酶消化法获取兔关节软骨细胞[2，6]，分别构建琼脂板-软骨细胞团块悬浮培养体系和常规单层贴壁培养体系[1，3，8]，进行体外扩增和传代。通过观察细胞形态、生长动力学特点和Ⅱ型胶原蛋白表达情况综合判断表型维持情况，现报道如下：

    1 对象与材料 ......