仲韵

    南京医科大学附属淮安第一医院老年科，江苏淮安223300

    单色多重荧光实时定量PCR测定端粒长度

    仲韵

    南京医科大学附属淮安第一医院老年科，江苏淮安223300

    目的在罗氏LightCycler 480上建立单色多重荧光实时定量聚合酶链反应(MMQPCR)方法测定端粒长度。方法在罗氏480定量PCR仪上使用MMQPCR方法测定39例人外周血白细胞端粒长度(相对T/S比值)，并与DNA印迹法(Southern blot)测得的平均末端限制性片段(TRF)长度作比较。结果MMQPCR方法测定端粒长度相对T/S比值为1.13依0.21，Southern blot方法测量平均TRF长度为(7.46依1.21)kb，两种方法测定结果的相关性分析R2=0.6706(P1 材料与方法

    1.1 材料

    实验标本选自2013年11月1~30日南京医科大学附属淮安第一医院(以下简称野我院冶)检验科体检者的肘静脉新鲜EDTA抗凝血2 mL，共40例，其中男19例，女21例，年龄38~79岁，平均(61.46依11.58)岁。本研究获得我院医学伦理委员会审查通过，所有入选者均签署知情同意书。

    1.2 方法

    1.2.1 单色多重荧光实时定量PCR测定端粒长度使用富士核酸提取系统提取基因组DNA，操作严格按照说明书进行。微量紫外分光光度计测DNA的浓度与纯度，OD260/280为1.7~1.9为合格，记录DNA的浓度。使用TB缓冲液将待测样本DNA浓度稀释至7 ng/滋L，任意选取一样本作为标准品，使用Milli-Q超纯水按1︰2.5的比例将标准品DNA浓度依次等比稀释为45、18、7.2、2.88、1.152 ng/滋L，并放于-20益冰箱保存备用。端粒长度的测定参照Cawthon2009年提出的MMQPCR[7]。反应使用的引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，序列如下院telg 5忆-ACAC-TAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT-3忆；telc 5忆-TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATC-CCTATCCCTAACA-3忆；hbgu 5忆-CGGCGGCGGGCG-GCGCGGGCTGGGCGGCTTCATCCACGTTCACCTTG-3忆；hbgd 5忆-GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCG-GAGGAGAAGTCTGCCGTT-3忆。反应体系院SYBR Green玉Master(罗氏公司)7.5滋L ......