何晓琴 徐细明 余佳骏 甘园园 韩娜娜 张美霞

    武汉大学人民医院肿瘤中心，湖北武汉430060

    lncRNA-AK058003诱导肝癌细胞凋亡的作用机制

    何晓琴徐细明余佳骏甘园园韩娜娜张美霞

    武汉大学人民医院肿瘤中心，湖北武汉430060

    目的探讨lncRNA-AK058003在肝癌细胞凋亡中的作用机制。方法采用lip2000转染法分别将过表达质粒(lncRNA-AK058003组)和空质粒(Vector组)转入HepG2和SMMC-7721细胞株，应用流式细胞术和蛋白质免疫印迹法来检测凋亡细胞及凋亡相关蛋白。结果构建上调lncRNA-AK058003的表达质粒，转染HepG2和SMMC-7721细胞株后，凋亡细胞数和凋亡率明显高于Vector组(P1 对象与方法

    1.1细胞培养

    人肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721购于中科院上海细胞库，按照50%培养基，40%血清和10% DMSO进行梯度冻存，保存于液氮中。HepG2采用含有10%Gibico胎牛血清和1%青-链霉素的Hyclone DMEM培养基，而SMMC-7721在含10%Gibico胎牛血清和1%青-链霉素的Hyclone RPMI培养基置于37℃、5%CO2细胞培养箱培养。

    1.2逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)

    将构建的过表达质粒及空质粒分别转染HepG2和SMMC-7721细胞。转染48 h后，用Trizol提取总RNA[12]，并用Nano-Drop2000C紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度。然后按TOYOBO试剂盒(QPK-201，日本)说明书将RNA反转录成cDNA。最后按照Takara qRT-PCR试剂盒说明书进行操作，设立3个复孔，GAPDH为内参基因，7500 Fast System SDS软件分析Ct值，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。引物序列由武汉巴菲尔生物有限公司设计合成：GAPDH-F：5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTG-3'；GAPDH-R：5'-AGGG GCCATCCACAGTCTTC-3'；AK058003-F：5'-GGGAAC AAAGATGGTTTCTACGT-3'；AK058003-R：5'-ACTGGT TCATAGTTAGGCTGGAT-3'。

    1.3过表达lncRNA-AK05800质粒的构建

    用PCR仪扩增并获取目的基因，琼脂糖电泳进行验证。然后将10 μL的PCR产物与载体GV144(上海吉凯基因化学技术有限公司)交换反应产物转化到100 μL感受态细胞E.coli中 ......