柳青+梁梅花+张幸

    [摘要] 目的 观察芒柄花黄素对人膀胱癌细胞T739增殖与凋亡的影响及其机制探讨。 方法 分别采用0、15、30、60 μmol/L的芒柄花黄素作用T739细胞后，CCK8法检测T739细胞的增殖情况，流式细胞术检测凋亡率的变化，Hoechst 33258荧光染色法观察凋亡情况，Western blot检测GSK-3β、Axin、β-catenin蛋白含量变化。 结果 15、30、60 μmol/L的芒柄花黄素以浓度和时间依赖方式明显抑制T739细胞的增殖(P 98%)、二甲基亚砜(DMSO，纯度98%)、荧光染料Hoechst33258购自美国Sigma公司，RPMI-1640培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司，人膀胱癌细胞株T739由中科院上海细胞生物研究所提供，实验所用GSK-3β、Axin、β-catenin一抗均购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG二抗为北京中杉金桥生物技术公司生产，CCK8试剂盒、V-FITC凋亡检测试剂盒购自上海碧云天研究所，总蛋白测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，全自动酶标板分析仪由美国Bio-Rad公司生产，FACSAriaⅢ流式细胞仪由美国BectonDickson公司生产。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养 人膀胱癌细胞T739在37℃、5% CO2环境下置于含10%胎牛血清(FBS)和100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养基培养。

    1.2.2 药物配制 芒柄花黄素与二甲基亚砜溶液配成浓度为100 mmol/L药液，置于4℃冰箱避光保存，待使用时以完全培养基按比例稀释成0(对照组)、15、30、60 μmol/L浓度药液。

    1.2.3 CCK8法检测T739细胞的增殖活性 取对数生长期T739细胞，以细胞浓度6×103个/孔，每孔100 μL细胞悬液接种于96孔培养板中，在细胞培养箱内培养24 h后取出，弃培养液，分别加入“1.2.2”项下浓度药液，每组设5个复孔。继续孵育24、48、72 h后，避光每孔加入10 μL CCK8溶液，继续培养2 h后取出，酶标仪于450 nm波长测定吸光度OD值，实验重复3次，结果取算数均数。细胞增殖抑制率=(1-实验孔平均OD值/对照孔平均OD值)×100% ......