超高效液相色谱法测定大豆异黄酮胶囊中异黄酮的含量
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【摘 要】 目的 建立同时测定大豆异黄酮胶囊中6种异黄酮含量的超高效液相色谱法(HPLC)。方法 采用Acquity UPLCTM BEH C18柱(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)，流动相为甲醇-0.05 mol/L乙酸胺(pH4.6)，梯度洗脱，检测波长为260 nm，流速为0.4 ml/min，柱温为40℃，外标法测定。结果 大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素分别在0.026 00～0.260 0 mg/ml、0.026 25～0.262 5 mg/ml、0.026 75～0.267 5 mg/ml、0.012 650～0.126 50 mg/ml、0.012 525～0.125 25 mg/ml、0.012 750～0.127 50 mg/ml范围内线性关系良好(r≥0.993 0)，加样回收率(6例)分别为：98.5%、98.8%、98.2%、97.7%、98.0%、97.3%。结论 本法快速、简便、准确、灵敏度高、成本低，适用于大豆异黄酮胶囊中异黄酮的含量测定及质量控制。
【关键词】 大豆异黄酮胶囊;异黄酮;超高效液相色谱法;含量测定
大豆异黄酮是大豆生长中形成的一种次生代谢产物，是生物黄酮的一种，也是天然的植物雌激素，具有抗衰老、抗肿瘤、防治骨质疏松、预防心脑血管疾病，以及抗高血压、降血脂等功效。大豆异黄酮胶囊性质稳定，安全有效，在临床上和保健品领域上得到广泛应用[1-2]。 大豆异黄酮又名类黄酮，目前发现的大豆异黄酮包括游离型苷元和结合型的糖苷两类共有12种，其主要成分有大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素。采用传统HPLC法测定时，检验周期长，低含量组分的检出效果不理想[3]。UPLC 的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC 的9、3及1.7倍[4]，本文采用超高效液相色谱法同时测定大豆异黄酮中6种有效成分的含量，快速、准确且成本低廉。
1 仪器与试药
Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪，紫外检测器，Empower 2色谱工作站。
大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素对照品由中国药品生物制品检定所提供，含量测定用大豆异黄酮胶囊(20060501、20060502、20060503)由广东康雅生物制药公司提供。甲醇为色谱纯，实验用水为超纯水。
2 实验方法
2.1 色谱条件 Acquity UPLCTM BEH C-18柱，1.7 μm，2.1 mm×50 mm，甲醇-0.05 mol/L乙酸胺(pH4.6)为流动相，梯度洗脱，洗脱条件见表1；检测波长为260 nm；流速为1.0 ml/min；柱温为40℃；进样量为2 μl。对照品液、样品液及阴性对照液的色谱图如图1所示。
0.05 mol/L乙酸胺溶液(pH=4.6)∶准确称取3.85 g乙酸铵于烧杯中，用适量水溶解转移至1 000 ml容量瓶中，加水500 ml，加入3.00 ml冰醋酸，摇匀，加水至刻度，摇匀。
2.2 溶液制备
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取五氧化二磷干燥至恒重的大豆苷(Daidzin)、黄豆黄苷(Glycitin)、染料木苷(Genistin)、大豆苷元(Daidzein)、黄豆黄素(Glycitein)和染料木素(Genistein)对照品，加甲醇制成每1 ml分别含0.10、0.10、0.10 、0.05、0.05、0.05 mg的溶液，作为对照品溶液，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，即得。
3 实验结果
3.1 线性关系 分别称取对照品适量，精密称定，用甲醇制成每1 ml中含大豆苷1 mg、黄豆黄苷1 mg、染料木苷1 mg、大豆苷元0.5 mg、黄豆黄素0.5 mg、染料木素0.5 mg的混合溶液，摇匀，作为储备液。分别精密量取储备液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml置于10 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度。按上述色谱条件下平行测定3 次，以峰面积的平均值Y对浓度X(mg/ml)进行线性回归。计算大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素的回归方程
3.2 重复性试验 取大豆异黄酮胶囊(20060501)，按“2.2.2”项下方法平行制备5份样品溶液，分别测定其含量，大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的含量测定结果的RSD分别为0.8%、0.9%、0.5%、1.0%、1.3%、1.6%。
3.4 检测限和定量限 将对照品溶液逐步稀释后进样，以信噪比为3 计，大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的最低检测限浓度分别为5.2、4.8、6.5、3.8、4.2、4.6 ng，以信噪比为10 计，大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的定量限浓度分别为38.5、32.3、40.8、28.4、34.0、38.8 ng。
3.5 加样回收率 取己知含量的大豆异黄酮胶囊内容物9份各125 mg，精密称定，分别精密加入“2.2.1”项下的混合对照品溶液8、8、8、10、10、10、12、12、12 ml，按“2.2.2”项下方法处理后，含量测定项色谱条件下测定，大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的平均回收率分别为98.5%、98.8%、98.2%、97.7%、98.0%、97.4%，RSD分别为0.8%、0.5%、1.1%、1.0%、0.8%、0.6%。
3.6 含量测定 取3批样品，按“2.2.2”项下方法处理，上述色谱条件下，精密量取样品溶液0.2 μl注入液相色谱仪中，按外标法定量，测定结果 见表2。
4 讨论
4.1 波长选择 取大豆异黄酮对照品混合溶液在190～400 nm内进行紫外扫描(见图2)，结果发现，在260 nm处有最大吸收峰，且总峰面积最大，由此确定紫外检测器的检测波长为260 nm。
4.2 柱温选择 柱温影响大豆异黄酮有效成分的保留时间及分离度，柱温过高，分离度不好，影响色谱柱寿命；柱温过低，分析时间延长，灵敏度降低[5]。通过试验，本方法确定柱温为40℃。
参考文献
1 江和源,吕飞杰,邰建祥，等.高效液相测定大豆中异黄酮的含量.食品科学,2000,21(4):56-58.
2 张蓓.大豆异黄酮的生物活性及保健功效.职业与健康,2006，22(3):176-178.
3 王春蛾,刘叔义.大豆异黄酮的成份、含量及特性.食品科学,2000,19(4):23-30.
4 吴小刚,吴周和,吴传茂，等.高效液相色谱法测定大豆制品中异黄酮的含量.中国酿制,2006(7):65-67.
5 孙梅君,骆炼,史长颖，等.中国大豆制品中异黄酮含量测定和分析研究.食品与发酵工业,1999,26(5):14-18., 百拇医药(吴昭怡 王洁梅 吴爱琴)